EZNA 质粒提取经验和步骤.doc

自己的实验刚刚开始，又涉及到质粒的提取。翻译了OMEGA 的大/小规模质粒提取试剂盒的说明书（D6922-01和D6942-01）。希望能给和我一样的新手一点帮助，同时请大家指正多给建议，特别是自己的心得啊。全是自己打的，帮顶让大家都能下啊E.Z.N.A Plasmid Miniprep Protocol 质粒小规模提取试剂盒Product Number D6942 and D6943,D6944注意：1．??使用之前，把试剂盒中的一小管RNA酶加入溶液Ⅰ. 4℃保存2．??加60ml 100%乙醇到DNA Wash Buffer Concentrate中.　室温保存除试剂盒外还需准备：可达到10000×g的离心机无核酸酶的离心管无菌去离子水或TE缓冲液纯乙醇操作规程：(提取过程在室温下进行)：1．??在10-20ml试管中，将携带有所需质粒的E.coli接种到5ml （师兄说是5到7ml） (培养基LB（含氨苄青霉素50μg/ml），37co振荡培养12-16h。需特别指出的是：endA阴性的E.coli菌株用于常规质粒提取，如DH5α和JM109.2．??取1.5~5ml菌液室温10000×g离心1min3．??去上清，加250μl溶液Ⅰ（含RNase A），涡漩振荡器震荡至菌体完全悬浮。4．??加入250μl溶液Ⅱ，温和颠倒离心管4~6次，获得澄清的裂解液。最好室温孵育2min，剧烈混合会使剪切染色体DNA，降低质粒纯度。(储存溶液Ⅱ应拧紧瓶盖)5．??加350μl溶液Ⅲ，温和颠倒数次混合，至出现白色絮状沉淀，室温10000×g离心10min.6．??特别小心吸取上清，移至洁净的装配好容积2ml离心管的吸收柱中。要保证没有吸入沉淀和细胞碎片。室温10000×g离心1min，至裂解物完全通过吸收柱7．??弃滤过液，加500μl Buffer HB，10000×g离心1min，清洗吸收柱，除去残余蛋白质保证DNA的纯度。如果接下来的步骤对质粒纯度要求不高，如酶消化法等其它筛选方法，此步可省略8．??弃滤过液，再用100%乙醇稀释的750μl Wash Buffer清洗吸收柱，10000×g离心1min注意：Wash Buffer浓缩液用前必须用纯乙醇稀释，方法见标签如果经过冷冻，用前必须恢复室温9．??此步可选：再加750μl Wash Buffer清洗吸收柱10.必须将吸收柱10000×g离心1min确保乙醇被去除，乙醇会影响下面的步骤。11.将吸收柱放入干净1.5ml离心管，加50-100μl(取决于需要的终浓度)无菌去离子水或TE缓冲液在滤膜上，10000×g离心5min，一次可洗脱75-80%附着DNA（可进行再洗脱，但会降低DNA浓度）。12. 检测：方法A：分别在260nm和280nm波长下测定20-50倍稀释液的吸光度DNA浓度＝260nm吸光度×50×稀释因子μg/ml高质粒拷贝数能达到5ml培养液得到25μg DNA，如果260nm吸光度/280nm吸光度大于1.8，说明核酸大于90%。方法B：和预知浓度DNA样品（Marker）一起做琼脂糖凝胶/嗅乙啶电泳，对比结果　　 （通常情况得到的DNA是单体超螺旋，也有少量多联体）E.Z.N.A. Plasmid Maxi Kit (D6922-01)质粒大规模提取试剂盒注意：1．??使用之前，把试剂盒中的一小管RNA酶加入溶液Ⅰ. 4℃保存2．??加84ml 100%乙醇到DNA Wash Buffer Concentrate中.　室温保存除试剂盒外还需准备：配有浮桶式转头(吊桶式转头)的离心机可达到12000×g的高速离心机50ml无菌离心管高速离心管无菌去离子水或TE缓冲液纯乙醇操作规程：(提取过程在室温下进行)1．??将带有目的质粒的大肠杆菌接种到200－500ml　LB（含氨苄青霉素50μg/ml），1－4升培养瓶中37℃震荡培养过夜（12-16h）需特别指出的是：endA阴性的E.coli菌株用于常规质粒提取，如DH5α和JM109.2．??取500ml菌液装入适当管子(推荐用250ml离心瓶)中，室温下3500-5000×g离心10min3．??小心去上清，用洁净纸巾吸干管壁残留液体。加7.0ml溶液Ⅰ，吹打数次，用旋涡振荡仪充分悬浮沉淀4．??移入50ml至少可承受12000×g的离心管，加7.0ml溶液Ⅱ，轻轻来回翻转混合7－10次，至澄清裂解液注意：必须室温下孵育5－10min　　　避免大力混合，以减少对染色体DNA的机械力切割，提高质粒纯度5．??加10ml溶液Ⅲ，温和倒转数次，至有絮状沉淀形成室温孵育5min并不时混合室温离心