抗氧化酶和MDA以及蛋白测定指南.docVIP

提取：0.3g叶样/根样，2mL 50mM PBS（PH=7.8，含0.2mM EDTA，2%（w/v）PVP），少许石英砂。冰浴研磨，12000g（rcf）离心20min，取上清液（2mL离心管或者10mL离心管），此上清液用于测定各种酶与MDA含量（上清液4℃保存且不宜存放太长时间）。 母液配制： 0.1M PBS（PH=6.8）：51mL A+49mL B，定容至200mL。 0.1M PBS（PH=7.0）：39mL A+61mL B，定容至200mL。 0.1M PBS（PH=7.8）：8.5mL A+91.5mL B，定容至200mL。 PBS 4℃保存 A（1或2都行）：1、0.2M NaH2PO4【NaH2PO4.H2O 27.60g——1000mL（13.80g——500mL）或者NaH2PO4.2H2O 31.20g——1000mL(15.60g——500mL)】 2、0.2M KH2PO4 【KH2PO4.H2O 30.8g——1000mL（15.4g——500mL）】 B（1或2都行）：1、 0.2M Na2HPO4 【Na2HPO4.7H2O 53.65g——1000mL（26.83g——500mL）或者Na2HPO4.12H2O 71.70g——1000mL（35.85g——500mL）】 2、0.2M K2HPO4【K2HPO4.3H2O 45.64g——1000mL（22.82g——500mL）】 A、B液常温储存即可。 提取液配制： 50mM PBS【PH=7.8，含0.2mM EDTA】：100mL 0.1M PBS（PH=7.8）+0.0116g EDTA，定容至200mL，调PH至7.8。 反应液配制： 25mM PBS【PH=6.8，含0.1mM EDTA】：25mL 0.1M PBS（PH=6.8）+0.0029g EDTA，定容至100mL，调PH至6.8。 25mM PBS【PH=7.0，含0.1mM EDTA】：25mL 0.1M PBS（PH=7.0）+0.0029g EDTA，定容至100mL，调PH至7.0。 25mM PBS【PH=7.8，含0.2mM EDTA】：25mL 0.1M PBS（PH=7.8）+0.0058g EDTA，定容至100mL，调PH至7.8。 25mM HEPES【PH=7.8，含0.2mM EDTA】：0.6508gHEPES，sodium salt定容于100mL，加0.0058g EDTA，调PH=7.8。 一、SOD（超氧化物歧化酶）活性 NBT反应液：含有50mM PBS【PH=7.8】，13mM 甲硫氨酸，63μM NBT，1.3μM 核黄素，0.1mM EDTA（现配） 配制：200mL NBT反应液（PH=7.8）含有50mM PBS【PH=7.8】 196mL，甲硫氨酸0.387g，NBT0.0103g，320μM 核黄素4mL（0.01204g溶于100mL水中）。 测定：上清液50μL + NBT反应液3mL，于25℃下照光约2分钟【以颜色决定时间，颜色变为淡灰色时，立即测定，需有颜色梯度】，测A560。 注意：受光均匀，空白50μL 50mM PBS【PH=7.8】+3mL NBT反应液作本底（3个空白求出一个mean值，代入公式计算），以缓冲液调零【空白OD值在0.25左右。0.2到0.28之间都可以】。 计算： SOD activity=(means-A560)/means*2【之前称为一个unit】*2300【0.3g样品用2000μL研磨】/50【取50μL测酶活】/(3085.2*protein+9.5483)【蛋白含量的标准曲线】/2.3【0.3g样用2000μL研磨】*1000（Unit mg-1 protein） 二、CAT（过氧化氢酶）活性（常温20℃~25℃反应，一般为负值，-0.01~-0.02之间） 反应混合液：25mM PBS【PH=7.0，含0.1mM EDTA】，10mM H2O2 ，酶液，总体积2000μL，240nm比色，时间扫描。 PBS 1700μL 100mM H2O2 200μL（现配现用。510μL 30% H2O2 定容于50mLDDW，50mL离心管避光，放于冰中） 酶液 100μL（放于冰盒） 添加顺序：PBS（每个玻璃试管事先加好）——酶液——H2O2 注意：以水调零，做一个加一个，顺序如上，加完混匀。酶液需要依样更换枪头，H2O2 不需更换枪头。 计算： CAT activity=OD*60/39.9*2*2300/100/(3085.2*protein+9.5483)/ 2.3*1000（μmol m