酶法催化生产母乳脂肪替代物001.docVIP

酶法催化生产富含1,3-二油酸-2-棕榈酸的母乳脂肪替代物 方法总结 酸解反应（PPP和OA为例） 酸解反应：sn-2位富含P的甘油三酯与酰基供体（自由脂肪酸）按设定比例混合加入具塞三角瓶中，加入RMIM酶作为催化剂，正己烷作溶剂（或无溶剂）。置于不同温度，200rpm摇床中。 反应实例：PPP 100mg，油酸200mg，加入3mL正己烷，酶RMIM24mg，置于55℃，200rpm摇床中反应，反应2h，4h，6h，8h分别取样100uL进行总FA及sn-2位脂肪酸分离，经过甲酯化后进行气相色谱检测。 分离甘油三酯　TAG 通过薄层层析进行甘油三酯的分离。硅胶板用之前在105℃烘箱中进行火化30min。取出的反应产物样品通过离心出去催化剂，点样于层析的硅胶板上（10cm*20cm）,置于层析缸中进行薄层层析。层析液为石油醚：乙醚：乙酸=90：10：0.1，以三油酸甘油三酯作为对比物，找出甘油三酯（TAG）条带。刮取条带，根据甲酯化的方法进行甲酯化，待气相色谱进行检测其中总脂肪酸的组成。 其中，硅胶板可以自制：配制0.5%的羧甲基纤维素钠溶液（加热70℃，搅拌2h，静置一夜），硅胶与CMCC-Na 1:3混合，搅拌均匀，平铺于洗干净烘干的玻璃板上，平面左右前后摇晃至硅胶均匀的平铺在板上，自然晾干。用之前必须经过105℃烘箱烘至少0.5h进行活化。 Sn-2位脂肪酸分析 将1mL样品真空浓缩成200uL后，加入10mL试管中，加入20mg胰脂肪酶和2mLTris-HCL缓冲液（2mol/L，pH=8）,摇匀后加入0.5mL胆酸钠溶液（1g/L）及0.2mL氯化钙溶液（220g/L），摇匀，置于40℃水浴锅中5min，混合振荡摇匀后再置于水浴锅5min，再振荡摇匀后，加入1mL无水乙醚和1mLHCL溶液（6mol/L）。振荡摇匀后5000rpm离心2min，取上层乙醚层经氮吹至约100uL，点样于硅胶板进行薄层层析。刮取单甘酯条带，按甲酯化的方法进行甲酯化后待气相检测sn-2位脂肪酸分布。 甲酯化 4.1根据ISO 6800：（1997）的方法，取待测样品，加入4mLNaOH甲醇溶液，置于80℃水浴，接入冷凝装置，至沸腾10min后加入5mL BF3甲醇溶液，继续加热20min,加入3mL异辛烷，最后加入饱和食盐水，吸取上层有机相于样品瓶中待测。 4.2 KOH甲醇溶液催化：配制约2mol/L的KOH甲醇溶液。取样品（不含自由脂肪酸）60mg，加入2mL异辛烷（色谱纯），摇晃至完全溶解，加入200uLKOH甲醇溶液，振荡摇晃1min，加入一水合NaHSO4除去多余的碱，至澄清后取出至GC检测。但此方法不适合含自由脂肪酸的样品，只适合甘三酯的检测。 GC检测条件 采用Agilent7890A（氢火焰检测器）进行气相色谱分析。色谱柱：DB-FFAP毛细管色谱柱(0.25um×0.25mm×30m)：Agilent公司；载气(N2)， 20 mL/min；前进样口：250℃，分流比40:1；前检测器（FID）：260℃，干燥空气流速350 mL/min，氢气流速30，尾吹10 mL/min；柱箱：60℃维持2 min，20℃/min升温至180 ℃，维持2min，5℃/min升温至230℃，维持10min，共运行30 min。进样量：1uL。采用面积归一化法进行数据处理分析。