拟南芥原生质体制备.docxVIP

拟南芥原生质体的制备 (Liu et al., 2013) 拟南芥原生质体分离前要求：a.保持拟南芥生长条件稳定；b.大约3-4周大的抽叶前苗子用于分离原生质体；c.选择健康未受到胁迫的苗子；d.一般用15mL酶解液酶解20片叶子每次可以做大约15个转化。 ①试剂配制： 母液试剂： 18.2g Mannitol（182.17g/moL）溶于ddH2O，定容至100mL得到1M Mannitol。 1.49g KCl（74.55g/mol）溶于ddH2O，定容至100mL得到0.2M KCl。 11.1g CaCl2（110.98g/mol）溶于ddH2O，定容至100mL得到1M CaCl2。 4.76g MgCl2（95.21g/mol）溶于ddH2O，定容至100mL得到0.5M MgCl2。 1.95g MES（195.2g/mol）溶于80mL ddH2O，用KOH调pH=5.7，再定容至100mL得到0.1M MES。 8.99g NaCl（58.44g/mol）溶于ddH2O，定容至100mL得到1.54M NaCl。 酶解工作液配方如下： 组分 母液需求量 1-1.5% Cellulase R10 0.225g 0.4% Macerozyme R10 0.06g 0.4M Mannitol 6mL 20mM KCl 1.5mL 20mM MES（pH5.7） 3mL 55℃水浴10min（抑制蛋白酶活性并增加酶溶解性），冷却至室温后再加入下列试剂。 10mM CaCl2 150uL 0.1% BSA 0.015g ddH2O 2.35mL Total 15mL 在加入酶粉末之前MES溶液先70℃预热2-3min，最后得到的酶解液是淡褐色，澄清的，酶解液最好用0.22μm孔径的滤膜过滤。 W5 Solution配方： 组分 母液需求量 154mM NaCl 10mL 125mM CaCl2 12.5mL 5mM KCl 2.5mL 2mM MES（pH5.7） 2mL ddH2O 73mL Total 100mL PEG40%（m/V）： 组分 母液需求量 PEG4000 8g 0.2M Mannitol 4mL 0.1M CaCl2 2mL ddH2O 6mL Total to 20mL PEG溶液在转染前1h配置好，确保PEG能够充分溶解。常温下保存并在5d内使用，抽滤灭菌。 MMG Solution： 组分 母液需求量 0.4M Mannitol 4mL 15mM MgCl2 300mL 4mM MES（pH5.7） 400mL ddH2O 5.3mL Total 10mL ① 实验步骤： A. 配制好的酶解液倒入50mL干净、干燥的三角瓶中，同时将挑选健康、良好的拟南芥叶片10片左右浸泡在之前准备的0.4M Mannitol中并在0.4M Mannitol环境中用锋利的刀片切成0.5-1mm宽的丝； B. 切好的叶片放入三角瓶中，完全浸没在酶解液里，用真空泵于黑暗中抽真空5-30min（至不冒泡）； C. 于40rpm摇床上避光酶解2-3小时； D. 加入等体积的W5 solution终止酶解反应； E. 用W5 solution润湿35μm滤膜，然后将上述溶液过滤到50mL圆底离心管中； F. 4℃，100g，8min，加速减速3-4档； G. 小心吸出上清弃去（去尽上清）再用5-10mL预冷W5 solution，轻柔重悬原生质体，4℃，100g，8min； H. 小心去上清，视原生质体数目用适量W5 solution，重悬原生质体（至数目大约为2×105mL-1）冰浴30min（可放置过夜，转化前再进行下一步）； I. 同步骤7，4℃，100g，8min，弃上清，换MMG solution，重悬原生质体，至原生质体数为2×105mL-1。 J. 将质粒浓度为1-1.5mg/mL的质粒取20mL至2mL离心管中（双转各10mL）； K. 每次操作一管，加200mL原生质体和220mL PEG溶液,立即轻柔颠倒混匀，室温放置10min； L. 加入800mL W5溶液，稀释轻混匀； M. 室温23℃，100g，8min，加速减