减数分裂染色体观察方法.docVIP

水稻减数分裂染色体及纺锤体观察方法 一、水稻减数分裂染色体观察方法： 田间采集处于减数分裂期的幼穗（日本晴叶枕距为-3cm~+1 cm左右），用EAA固定液(乙醇:乙酸=3:1)固定，室温放置10小时后放入4℃冰箱中待用。 挑取适合大小的幼穗于载玻片上，用尖头镊子及解剖针分离出一枚花药，滴加一滴醋酸洋红，盖上盖玻片，酒精灯火焰上瞬时烘烤，迅速压片。 显微镜下观察，初步判断发育时期（日本晴花粉母细胞直径约为30μm，而四分体后的游离小孢子的直径约为其一半左右）。 如为减数分裂时期，则将剩余的5枚花药（水稻共6枚花药，确定时期用去1枚）取出作为下一步荧光染色的材料。 将上述5枚花药置于载玻片上，滴加一滴45%醋酸，盖上盖玻片，用镊子轻敲材料两下，以释放花粉母细胞，迅速压片。 压好的载玻片放入液氮上冰冻10-20分钟（勿将载玻片浸入液氮中），用刀片迅速揭去盖玻片，室温晾干待用。 滴加一滴PI（20μg/ml）,染色2-5分钟后在荧光显微镜下观察（绿色激发光），照相。 二、水稻减数分裂纺锤体观察方法 田间采集新鲜的处于减数分裂期的幼穗（日本晴叶枕距为-3cm~+1 cm左右），用8% (v/v)多聚甲醛（PHEMS buffer配制，60 mM Pipes, 25 mM Hepes, 10 mM EGTA, 2 mM MgCl2, and 0.32 M sorbitol, pH 6.8）固定2个小时，放入4℃冰箱中待用（不宜存放过久）。 挑取适合大小的幼穗于载玻片上，用尖头镊子及解剖针分离出一枚花药，滴加一滴醋酸洋红，盖上盖玻片，酒精灯火焰上瞬时烘烤，迅速压片。 显微镜下观察，初步判断发育时期（日本晴花粉母细胞直径约为30μm，而四分体后的游离小孢子的直径约为其一半左右）。 如时期为减数分裂时期，则将剩余的5枚花药（水稻共6枚花药，确定时期用去1枚）取出作为下一步荧光染色的材料。 将上述5枚花药置于1.5 ml离心管中，用PHEMS buffer清洗2遍。加入20μl左右的PHEMS buffer，用镊子或枪头将花药捣碎，释放花粉母细胞。 用移液器吸出10μl含有花粉母细胞的液体到一个新的离心管中，加入10μl的3%低凝胶度琼脂糖（Sigma A2756 PHEMS buffer配制），混匀后，置于4℃冰箱中，使琼脂糖凝固。 向离心管中加入 100μl的1.5% β-葡萄糖醛酸酶(Sigma G0751)，室温孵育过夜以消化细胞壁。 用PBS清洗琼脂块3次，每次30分钟。加入50μl 鼠抗微管蛋白的单克隆抗体（Sigma T9026 PBS 1:100稀释)，室温孵育过夜。 PBS清洗琼脂块3次，每次60分钟。加入50μl FITC偶联的羊抗鼠IgG单克隆抗体（Sigma F-0257 PBS 1:200稀释)，室温孵育过夜。 PBS清洗琼脂块3次，每次60分钟。加入50μl 的PI（20μg/ml）染色2小时。 琼脂块用PBS冲洗后放于载玻片上（载玻片预先用透明胶带贴上，中间留出一个18×18的方块），滴加一滴抗褪色剂。 55℃加热直到琼脂块融化，盖上盖玻片，在激光共聚焦显微镜上观察并照相。