lamp引物设计入门.pdf

LAMP引物设计简介 第一部分，如何查找序列 首先，登录 NCBI( 美国国立生物技术信息中心) 的网站，网址 /，查找我们所需要的序列，具体操作如下： 点开NCBI 的主页，点开All Datebases，选中下拉菜单中的Nucleotide，然 后在右边对话框中输入我们所需要查找的物种的拉丁名以及基因的英文名称。 选 中 在此处输入需 Nucleotide 要查找的信息 比如说我要查找大肠杆菌的16SrDNA的序列，那么只需要将大肠杆菌的拉丁名 Escherichiacoli 以及16SrDNA 输入即可，如下图所示，然后点击search。 NCBI GenBank 如果 的 数据库有这些序列，那么我们就可以找到我们所需要的 序列了。当然，数据库中可能会出现很多相关的序列，这时我们需要自己慢慢查 找自己需要的序列信息，如下图所示： 接下来我们就浏览这些信息，然后将我们需要的信息复制下来，粘贴到TXT或 者Word 里。这里我们示例选中的是第20 条信息，当然你可以打开所有的你需 要的信息。如下图所示，我们可以得到基因的全部信息，包括来源、出自那片文 献、核酸序列等等。 这样，我们的序列查找就完成了。当然并不是所有物种的基因都可以在这里找到， 在查不到的情况下，就需要我们自己通过PCR的方法将我们所需要的基因扩增 出来，然后测序获得序列信息。 第二部分 序列比对 目前有一些分子生物学软件可以用于序列比对分析，像DNASTAR、 ClustalW、MEGA等等，这里我们以MEGA5.0为例进行讲解。 首先，将目标序列和其它需要与其比对的序列放入一个文本文档中，以大肠 杆菌的16SrDNA为例，格式如下图所示： 打开MEGA5.0 软件，点击Alignment 的下拉菜单，选取Alignment 的下拉 菜单，选取Edit/BuildAlignment， 出现一个AlignmentEditor的对话框，然后选择Creat anewalignment，点击OK。 出现下面的对话框，选择DNA 软件就会出现下图的界面，单击Edit，选择下拉菜单中的Insert SequenceFrom File 然后我们就把大肠杆菌的16SrDNA的序列及其他细菌的16SrDNA 序列上传， 出现下图的对话框，点击Alignment，选择下拉对话框的Align by ClustalW，对 这个序列进行比对。 这是对五条序列进行比对的结果，每种碱基软件会默认标记一种颜色，下图显示 是这五种细菌16SrDNA的保守区。从这个图上我们可以看出，在这段区域内碱 基序列很保守。 下面这段区域变异相对则比较大。 到这里序列比对工作基本就完成了。 第三部分 引物设计 首先介绍一下关于LAMP 设计的理论概念，基础法的LAMP 方法也就是4 条引物的情况，从F3 到B3 一般有300bp 这样的一个靶序列人为的分成六个区 域，命名为F3、 F2 、F1、 B1、 B2、 B3，那它对应的互补序列我们就命名 为F3c、F2c、F1c 、B1c、 B2c、 B3c，针对这六个区域实际上我们是设计了四 条引物，也就是内引物FIP 和BIP，外引物F3 和B3。F3 和 B3 的作用其实就 相当于PCR 的上下游引物，它除了不断提供模板这样一个作用以外，它还可以 在LAMP 反应之中起到置换FIP 和BIP 延伸而成的新链的作用。最关键的内引 物实际上是由两部份组成的，FIP 是3’端是F2 序列，BIP 的是B2 序列，比较特 殊的是在它们的5’端人为的加上了F1c和B1c这样一个序列。 LAMP 引物设计的关键因素有：Tm 值，引物末端的安定性，GC 含量，引 物间的距离，二级结构。首先，介绍Tm值，Tm值的定义是引物与模板完全结 合的双螺旋结构降解一半时的温度，通常GC含量比较高的引物要求的Tm值也 较高；反应溶液里核苷酸的浓度越高，引物与模板越容易结合，Tm 值也越大； 溶液中阳离子浓度越高，引物与模板的双链结构越稳定，Tm值也就越高。LAMP 中六条引物每条引物的Tm 值要