PCR操作步骤和常见问题解决.docVIP

聚合酶链式反应（PCR） 聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，为最常用的分子生物学技术之一。典型的PCR由（1）高温变性模板；（2）引物与模板退火；（3）引物沿模板延伸三步反应组成一个循环，通过多次循环反应，使目的DNA得以迅速扩增。其主要步骤是：将待扩增的模板DNA置高温下（通常为93℃-94℃）使其变性解成单链；人工合成的两个寡核苷酸引物在其合适的复性温度下分别与目的基因两侧的两条单链互补结合，两个引物在模板上结合的位置决定了扩增片段的长短；耐热的DNA聚合酶（Taq酶）在72℃将单核苷酸从引物的3’端开始掺入，以目的基因为模板从5’→3’方向延伸，合成DNA的新互补链。?? PCR能快速特异扩增任何已知目的基因或DNA片段，并能轻易在皮克（pg）水平起始DNA混合物中的目的基因扩增达到纳克、微克、毫克级的特异性DNA片段。因此，PCR技术一经问世就被迅速而广泛地用于分子生物学的各个领域。它不仅可以用于基因的分离、克隆和核苷酸序列分析，还可以用于突变体和重组体的构建，基因表达调控的研究，基因多态性的分析，遗传病和传染病的诊断，肿瘤机制的探索，法医鉴定等诸多方面。通常，PCR在分子克隆和DNA分析中有着以下多种用途：(1) 生成双链DNA中的特异序列作为探针；(2)? 由少量mRNA生成 cDNA文库；(3) 从cDNA中克隆某些基因；(4) 生成大量DNA以进行序列测定；(5) 突变的分析；(6) 染色体步移；(7) RAPD、AFLP、RFLP等DNA多态性分析等。一、试剂准备1. DNA模版2．对应目的基因的特异引物3．10×PCR Buffer 4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM5．Taq酶二、操作步骤 1．在冰浴中，按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。??????? 10×PCR buffer??????????????? 5 μl??????? dNTP mix （2mM）????????????? 4 μl??? 　? 引物1（10pM）???????????????? 2 μl????? 　引物2（10pM）???????????????? 2 μl??????? Taq酶 （2U/μl）????????????? 1 μl??????? DNA模板（50ng-1μg/μl）　??? 1 μl??????? 加ddH2O至???????????????????? 50 μl??? 视PCR仪有无热盖，不加或添加石蜡油。2． 调整好反应程序。将上述混合液稍加离心，立即置PCR仪上，执行扩增。一般：在93℃预变性3-5min，进入循环扩增阶段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循环30-35次，最后在72℃ 保温7min。3． 结束反应，PCR产物放置于4℃待电泳检测或-20℃长期保存。4．PCR的电泳检测：如在反应管中加有石蜡油，需用100μl氯仿进行抽提反应混合液，以除去石蜡油；否则，直接取5-10μl电泳检测。三、PCR反应体系的组成与反应条件的优化? 　PCR反应体系由反应缓冲液（10×PCR Buffer）、脱氧核苷三磷酸底物（dNTPmix）、耐热DNA聚合酶（Taq酶）、寡聚核苷酸引物（Primer1，Primer2）、靶序列（DNA模板）五部分组成。各个组份都能影响PCR结果的好坏。1． 反应缓冲液：一般随Taq DNA聚合酶供应。标准缓冲液含：50mM KCl，10mM Tris-HCl（pH8.3室温），1.5mM MgCl2。Mg2+的浓度对反应的特异性及产量有着显著影响。浓度过高，使反应特异性降低；浓度过低，使产物减少。在各种单核苷酸浓度为200μM时，Mg2+为1.5mM较合适。若样品中含EDTA或其它螯合物，可适当增加Mg2+的浓度。在高浓度DNA及dNTP条件下进行反应时，也必须相应调节Mg2+的浓度。据经验，一般以1.5-2mM（终浓度）较好。2． dNTP ：高浓度dNTP易产生错误掺入，过高则可能不扩增；但浓度过低，将降低反应产物的产量。PCR中常用终浓度为50-400μM的dNTP。四种脱氧三磷酸核苷酸的浓度应相同，如果其中任何一种的浓度明显不同于其它几种时（偏高或偏低），就会诱发聚合酶的错误掺入作用，降低合成速度，过早终止延伸反应。此外，dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。因此，dNTP的浓度直接影响到反应中起重要作用的Mg2+浓度。3． Taq DNA聚合酶酶：在100μl反应体系中，一般加入2-4U的酶量，足以达到每min延伸1000-