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间接免疫荧光  武汉大学基础医学院 免疫学教研室 潘勤 外周血单个核细胞分离 ----- 葡蔗糖-泛影葡胺密度梯度离心法 [原理] 外周血单个核细胞（PBMC）包括淋巴细胞、单核细胞，其体积、形状和比重与其他细胞不同。红细胞和多核细胞比重较大，为1.092左右，而淋巴细胞和单核细胞比重为1.075左右。利用比重为1.077左右的分层液作密度梯度离心，使一定比重的细胞按密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。 [材料] 1、淋巴细胞分层液（葡蔗糖-泛影葡胺，比重为 1.077±0.001g/L） 2、 2％台盼蓝染液 3、 Hank’s液或者RPMI-1640培养基 4、试管、吸管、水平离心机等 [方法] 1、无菌采集静脉血2ml注入盛有2ml Hank’s液（含100u/ml肝素）的试管中，混匀。 2、吸取淋巴细胞分层液2ml加入离心管中，再将稀释抗凝血液小心沿管壁加至分层液上，应注意保持两者界面清晰。（关键） 3、室温2000r／min离心20min。管内可分为四层。 4、用毛细吸管轻轻吸出乳白色的单个核细胞，加入另一支已含有2~5 mlHank’s液的离心管中，混匀。 5、室温下，1500 rpm离心10 min。 6、弃上清，将PBMC用1ml PBS稀释，混匀 PBMC 材 料 PBMC 兔抗人白细胞血清 (Ab1) FITC-抗兔单克隆抗体 (Ab2) 方 法 吸管取1滴PBMC液体（约10ul）滴加到标本片黑色圈圈背面中央, 静止5-10分钟，待PBMC干燥。 15 ml Ab1 加入玻片上湿盒内孵育 30min。 甩干玻片, 用洗脱液洗5次，甩干玻片 玻片上加15 ml 荧光二抗 (Ab2) 湿盒内孵育 30min。(避光操作) 甩干玻片, 用洗脱液洗5次，甩干玻片 用荧光显微镜观察结果 RESULTS 思考题 为什么用间接免疫荧光法可检测 PBMC细胞？ * * 间接免疫荧光检测人外周血单个核细胞 First antibody Target cells secondary antibody-fluorochrome 原 理