细菌内毒检查法讲义.ppt

背景介绍： 一、细菌内毒素 二、热原 三、鲎 一、细菌内毒素 细菌内毒素是一种革兰氏阴性细菌细胞壁的产物，当其死亡或菌体裂解时释放出的一类具有多种生物活性的毒性物质 特性： （1）.致热性：内毒素作用人体细胞，使之释放内源性热原，刺激下丘脑体温调节中枢，引起发热反应。 （2）.耐热性：需250度干热30分钟才能彻底灭活。 （3）.分子极性：多糖链亲水，脂肪链疏水，在水中呈不均匀分布。 （4）.鲎反应：能与鲎试剂发生多级酶促反应，形成凝胶。 二、热原 热原是指临床上引起哺乳动物发热反应的物质 细胞分裂素（ IL-1, IL-2, IL-6, IL-8 ） 内源性热原 产生细胞分裂素的物质 内毒素热原 外源性热原 非内毒素热原（病毒、细菌、真 菌、抗体-抗原复合物、细胞分裂素） 热原和内毒素的关系： 热原是否就是内毒素？ 在学术上仍有争议，热原不仅是细菌内毒素。但在药检的范畴，细菌内毒素是主要的热原物质，可以说无内毒素就无热原，控制内毒素就是控制热原。 细菌内毒素检查法的定义： 本法是利用鲎试剂与 细菌内毒素产生凝聚反应的机理，以判断供试品中的细菌内毒素限度是否符合规定的一种方法。 细菌内毒素检查法介绍 细菌内毒素检查包括： 限量实验 凝胶法 半定量实验 可使用其中任何一种方法进行试验。当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法结果为准。 试验的准备 实验所需物品 细菌内毒素标准物质 细菌内毒素检查用水 凝胶法鲎试剂 漩涡混合器 适宜的恒温器 37± 1℃ 电热干燥箱 250 ℃ 实验器械等 细菌内毒素检查用水 用于复溶内毒素标准品、稀释内毒素及样品、溶解鲎试剂等 a 凝胶法细菌内毒素检查用水系指内毒素含量小于0.015EU/ml的灭菌注射用水 b 光度测定法细菌内毒素检查用水，其内毒素含量应小于0.005EU/ml 漩涡混合器 漩涡混合器 干热恒温器 恒温水浴 试验器械 移液管（或刻度吸管、微量加样器及无热原吸头）、凝集管（10×75mm）、试管、试管架、洗耳球、封口膜、计时器、75%酒精棉、剪刀、砂轮。 实验操作: 取细菌内毒素国家标准品或工作标准品一支，加入规定量的细菌内毒素检查用水溶解其内容物，用封口膜将瓶口封严，置旋涡混合器上混合15分钟。 然后进行稀释，制备成4个浓度的细菌内毒素标准溶液,即2.0λ、1.0λ、0.5λ、0.25λ（λ为所复核的鲎试剂的标示灵敏度），每稀释一步均应在旋涡混合器上混合30秒钟。 坚实凝胶 阳性“+” 未形成凝胶 凝胶不坚实 阴性“—” 凝胶法干扰试验 目的：是确定供试品在多大的稀释倍数或浓度下对内毒素和鲎试剂的反应不存在干扰作用，为能否使用细菌内毒素检查法提供依据。 凝胶法干扰试验 预试验 正式干扰试验 正式干扰试验 操作：用内毒素检查用水和供试品将同一支内毒素标准品分别制备一系列浓度的内毒素溶液 凝胶法干扰试验 由于干扰实验检验的是在供试品存在的情况下内毒素与鲎试剂的反应是否正常，与所使用鲎试剂的灵敏度无关，因此在干扰实验中原则上可使用任一灵敏度的鲎试剂。 建议使用较低灵敏度（如0.5或0.25EU/ml）的鲎试剂，可尽量避免供试品所含的内毒素对干扰实验造成的阳性影响。 注意事项 实验前，须用肥皂洗手，用75％酒精棉球消毒 实验时须戴口罩、帽子 实验时不高声讲话及频繁走动，防止飞沫及尘埃落入 吸取样品时严禁嘴吸或吹，在使用洗耳球、移液管取样时，应注意不要将洗耳球中的气体吹入溶液中，以防止气体中的内毒素进入供试液 注意事项 注意所用试剂的批号、规格、有效期、灵敏度等信息 溶解鲎试剂及混匀供试品和鲎试剂时，不要剧烈振荡避免产生气泡。 由于凝集反应是不可逆的，所以在反应过程中及观察结果时应注意不要使试管受到振动，以免使凝胶破碎产生假阴性结果。 注意事项 进行干扰实验时，标准对照系列和含内毒素的供试品溶液系列应同时进行。 在进行鲎试剂灵敏度复核、干扰实验和供试品细菌内毒素检查时，各个实验中要求的对照应同时进行，并在实验有效的情况下才能进行计算和判断。 实验操作应在清洁环境中进行，过程中应防止微生