第六章-子制备与菌种保藏.ppt

(5) 冷冻干燥法 保藏对象：各种微生物。 保藏时间：5 - 10年。 保藏过程：将菌种制成悬浮液，与保护剂（一般为脱脂牛奶或血清等）混合，放在安瓿管内，用低温酒精或干冰（-15℃以下）使之速冻，在低温下用真空泵抽干，最后将安瓿管真空熔封，低温保存备用。 (6) 液氮超低温保藏法 保藏对象：各种微生物。 保藏时间：10年以上。 保藏过程：将要保存的菌种（菌液或长有菌体的琼脂块）置于10%甘油或二甲基亚砜保护剂中，密封于安瓿管内（安瓿管的玻璃要能承受很大温差而不致破裂）。先将菌液降至0℃，再以每分钟降低1℃的速度，一直降至-35℃，然后将安瓿管放入液氮罐的气相中保存（液氮上面的气相温度为-150℃以下）。 4、 菌种保藏的注意事项 （1）菌种在保藏前所处的状态 保藏用的孢子或芽孢等要采用新鲜斜面上生长丰满的培养物。 菌种斜面的培养时间和培养温度影响其保藏质量。一般以稍低于生长最适温度培养至孢子成熟的菌种进行保存，效果较好。 （2）菌种保藏所用的基质 斜面培养基碳源比例少，营养成分贫乏。 砂土管保藏需将砂和土充分洗净，以防其中含有过多的有机物，影响菌的代谢或经灭菌后产生一些有毒的物质。 冷冻干燥所用的保护剂过度加热往往形成有毒物质，灭菌时应特别注意。 （3）操作过程对细胞结构的损害 冷冻干燥时，冻结速度缓慢易导致细胞内形成较大的冰晶，对细胞结构造成机械损伤。 真空干燥程度也将影响细胞结构，加入保护剂就是为了尽量减轻冷冻干燥所引起的对细胞结构的破坏。 4、国内外重要菌种保藏机构 1、ATCC (American Type Culture Collection) 美国标准菌种收藏所， 马里兰州，罗克维尔市 2、CSH (Cold Spring Harbor Laboratory) 冷泉港研究室， 美国 3、IAM (Institute of Applied Microbiology, University of Tokyo) 日本东京大学应用微生物研究所， 日本东京 4、IFO (Institute for Fermentation, Osaka) 发酵研究所，日本大阪 5、普通微生物菌种保藏管理中心 （CCGMC ） 中科院微生物所，北京 6、工业微生物菌种保藏管理中心 (CICC) 轻工部食品发酵工业科学研究所，北京 7、医学微生物菌种保藏管理中心（CMCC） 中国医学科学院皮肤病研究所，南京 中国药品生物制品检定所，北京。 中国预防医学科学院病毒学研究所，北京 8、中国抗生素菌种保藏管理中心（CACC） 中国医学科学院医药生物技术研究所，北京； 四川抗生素工业研究所，成都； 华北制药集团抗生素研究所，石家庄。 9、兽医微生物菌种保藏管理中心（CVCC） 中国兽医药品监察所，北京。 10、林业微生物菌种保藏管理中心（CFCC） 中国林业科学研究院，北京。 11、中国典型培养物保藏中心 （CCTCC） 武汉大学 ， 武汉。 5、菌种的衰退与复壮（rejuvenation） 菌种的衰退 菌种衰退（degeneration）是指菌种经过长期人工培养或保藏，由于自发突变的作用而引起某些优良特性变弱或消失的现象。 （一）菌种衰退的具体表现 1）、菌落和细胞形态改变。每一种微生物在一定的培养条件下都有一定的形态特征，如果典型的形态特征逐渐减少，就表现为衰退。 2）、生长速度缓慢，产孢子越来越小。 3）、代谢产物生产能力的下降，即出现负突变。 4）、致病菌对宿主侵染能力下降。 5）、对外界不良条件（包括低温、高温或噬菌体侵染等）抵抗能力的下降等。 总之，退化是发生在群体细胞中的一个从量变到质变的逐步演变过程，由于个别突变细胞表现生长优势，导致在群体中最后数量占优势。 （二）菌种衰退的原因 1)、基因突变 2)、连续传代 3)、不适宜的培养和保藏条件 菌种的复壮 狭义的复壮是指在菌种已发生衰退的情况下，通过纯种分离和生产性能测定等方法，从衰退的群体中找出未衰退的个体，以达到恢复该菌原有典型性状的措施。 广义的复壮是指在菌种的生产性能未衰退前就有意识的经常进行纯种的分离和生产性能测定工作，以期菌种的生产性能逐步提高。 纯种分离 淘汰衰退的个体 选择合适的培养条件 复壮措施方法 1）、纯种分离法 通过纯种分离,可将衰退菌种细胞群体中一部分仍保持原有典型性状的单细胞分离出来,经扩大培养,就可恢复原菌株的典型性状。 “菌落纯”的水平——稀释平板法