含EGFP报告基因的HCV复制子表达载体的构建和表达.DOC

含EGFP报告基因的单顺反子HCV亚基因组复制子载体的构建和表达 陈中湘, 刘晓蕾，刘丽莎，邬国军，马琼山，刘水平 (中南大学湘雅医学院微生物学系, 湖南 长沙410078) [摘要] 目的 构建含增强型绿色荧光蛋白（EGFP）报告基因的HCV复制子表达载体，并实现其在细胞中复制表达。方法 用分子生物学基因克隆技术，对HCV 2a型复制子的基因进行改造，用EGFP基因替代HCV基因组中的包膜基因(E1和E2)，体外构建重组单顺反子HCV亚基因组复制子真核表达质粒pcDNA-JFH1-EGFP, 经限制性内切酶酶切分析和测序鉴定。脂质体介导转染人肝癌细胞系Huh-7细胞，荧光显微镜观察和半定量RT-PCR方法检测复制子的复制表达。结果 各重组质粒酶切分析结果与预期相符，HCV亚基因复制子表达载体中未发生EGFP和HCV编码区读码框架改变，转染Huh-7 细胞中检测到HCV 负链，并表达EGFP蛋白。结论 含EGFP报告基因的单顺反子HCV亚基因组复制子表达载体pcDNA-JFH1-EGFP的构建成功，在Huh-7细胞中能复制表达。结果为进一步研究HCV提供了有效实验平台。 关键词：丙型肝炎病毒; 复制子; 绿色荧光蛋白; 基因表达 丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus，HCV)是丙型肝炎的病原体，感染慢性化程度高，并可发展为肝硬化和肝细胞癌。目前治疗手段局限，也无预防性疫苗[1]。1999年Lohmann等[2]首先报道了选择性双顺反子亚基因组HCV RNA复制子系统的成功建立，复制子在人肝癌细胞系Huh-7中能高水平自主复制，这被公认为是HCV RNA体外复制模型研究获得突破性进展的里程碑。复制子系统的建立，对HCV致病机制、治疗药物筛选及疫苗方面的研究具有重要的意义。我们利用基因工程技术, 对HCV 2a型复制子的基因进行改造，用EGFP荧光蛋白报告基因替代HCV的包膜基因(E1和E2)，使细胞内HCV RNA的量与EGFP荧光蛋白正相关, 旨在建立一个能直观快速反映细胞内HCV RNA水平的细胞模型，为抗HCV药物的快速筛选和HCV的复制、致病机制等研究提供了实验平台。 材料与方法 1.1 重组表达载体的构建 根据HCV 2a JFH1 (GenBank accession No: AB047639) 基金项目: 湖南省科技计划项目( 2011FJ3057，2013SK3069)作者简介: 陈中湘( 1978 - ) , 男, 硕士，湖南邵阳人，检验师，主要从事分子病毒学研究。现在湖南省岳阳市一人民医院检验科。 基金项目: 湖南省科技计划项目( 2011FJ3057，2013SK3069) 作者简介: 陈中湘( 1978 - ) , 男, 硕士，湖南邵阳人，检验师，主要从事分子病毒学研究。现在湖南省岳阳市一人民医院检验科。 通讯作者: 刘水平, Email: spliu@csu.edu.cn pcDNA6/TR-Tight/JFH1/AR（以下简称HCV复制子）(美国Dr. Guangxiang Luo 惠赠[3])的序列结构，本研究采用HCV 2a JFH1基因组DNA的AgeI和AflⅡ位点为克隆位点，用EGFP基因替代HCV基因组中的包膜基因(E1和E2)，体外构建重组单顺反子HCV亚基因组复制子真核表达质粒pcDNA-JFH1-EGFP。构建流程如图1。PCR引物为： HCV-AgeI-F：5’-CCCAAGCTTCCATAGTGGTCTGCG-3’（下划线为 HCV-AgeI-R： 5’-CGGGATCCGCTGCTACTGGTATTCT-3’（下划线为 HCV-AfIⅡ-F ： 5’-CGGAATTCGCATTGGAGAAGTTGGTCGT-3’（下划线为 HCV-AfIⅡ-R ：5’-GCCTCGAGCGTACTTAAGAGGTAAGCAGG-3（下划线为Xho EGFP-F ： 5’-GCATAAGGATCCATGGTGAGCAAGGG-3’（下划线为 EGFP-R ： 5’-CGAGAATTCCTTGTACAGCTCGTCCATG-3’（下划线为 以HCV 复制子质粒DNA为模板，引物HCV-AgeI-F和HCV-AgeI-R PCR扩增HCV复制子含AgeI位点片段（HCV nt137～940）, PCR产物经HindIII和BamHI双酶切，克隆至pcDNA3.1(+)(Invirtrogen), 构建成重组质粒pcDNA3.1(+)-AgeI。以pEGFP-C1(Clontech) DNA为模板，引物EGFP-F 和EGFP-R PCR扩增EGFP 基因, PCR产物经BamHI和EcoRI双酶切，克隆至pcDNA3.1(+)-AgeI, 构建成重组质粒pcDN