模式植物拟南芥tdna插入突变体的鉴定.docVIP

姓名 系年级 学号 日期 科目 遗传学实验 题目 模式植物拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定 模式植物拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定 摘要： 农杆菌Ti质粒转化植物细胞后，在获得的后代分离群体中，有T-DNA插入的纯合突变体，杂合突变体，和野生型。在突变体研究中，需要的材料是纯合突变体。本次实验意在对模式植物拟南芥T-DNA插入突变体进行鉴定。实验中用到的主要实验方法有：CTAB法提取拟南芥基因组DNA、PCR扩增目的基因片段、琼脂糖凝胶电泳分离核酸。 PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩增目的基因扩增放大几百万倍。 琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖作支持介质的一种 电泳方法。它兼有“ 分子筛”和“电泳”的双重作用。带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量，而且还取决于分子大小，这就大大提高了分辨能力。DNA经EB染色，EB可与核酸结合，在紫外光激发下产生荧光。现广泛应用于 核酸的研究中。 引言 Ti质粒是土壤农杆菌的天然质粒，该质粒上有一段特殊的DNA区段，当农杆菌侵染植物细胞时，该DNA区段能自发转移进植物细胞，并插入植物染色体DNA中。所以Ti质粒上的这一段能转移的DNA被叫做T-DNA。将Ti质粒进行改造，将感兴趣的基因放进T-DNA区段中，通过农杆菌侵染植物细胞，实现外源基因对植物的遗传转化。 T-DNA插入基因内部导致基因突变：T-DNA插入到植物染色体上的位置是随机的。如果T-DNA插入进某个功能基因的内部，特别是插入到外显子区，将造成基因功能的丧失。所以利用农杆菌Ti质粒转化植物细胞，是获得植物突变体的一种重要方法。农杆菌能在自然条件下感染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有感染能力。这使农杆菌Ti 质粒转化系统的应用范围受到了一定的限制。 反向遗传学研究的首要条件是获得基因敲出突变体，建立可靠、有效、方便的T-DNA插入突变体的鉴定方法。其中，“三引物法”是主要鉴定方法之一。 “三引物法”即采用三个引物（LP、RP、BP）进行PCR扩增。野生型植株目的基因的两条染色体上均未发生T-DNA插入，所以其PCR扩增产物仅有1种，电泳结果为一条大带（由LP+RP这一对引物扩增出来）；纯合突变体植株目的基因的两条染色体上均发生T-DNA插入，也只能得到1种PCR扩增产物，电泳结果为一条小带（由BP+RP这一对引物扩增出来）；杂合突变体植株只在目的基因的一条染色体上发生了T-DNA插入，所以PCR扩增产物有2种，电泳结果为一条大带由（LP+RP这一对引物扩增出来）和一条小带（由BP+RP这一对引物扩增出来）。电泳结果差异明显，能有效区插入突变体的类型。 此法优点是可同时鉴定出纯合突变体并确证T-DNA的插入情况。本方法操作简单，成功率高，结果可靠，适用于从大量拟南芥T—DNA插入突变体中快速鉴定出突变体。 【实验材料】 1.试剂： 液氮，2*CTAB提取液，氯仿-异戊醇（24：1），无水乙醇，70%乙醇，TE，PCR反应体系（DNA模板（基因组DNA），引物LP、RP、BP，缓冲液，MgCl2，dNTP mixture，ddH2O，Taq酶），琼脂糖凝胶电泳（琼脂糖，1×TAE缓冲液，Loading buffer，DL 2,000 DNA Marker，λ-Hind Ⅲ DNA digest Marker，溴化乙锭。 2.器具： 1.5ml离心管，水浴锅，微量移液器，离心机，PCR仪，微波炉，电泳仪，电泳槽，梳子，三角瓶，微量天平，手套，染色盘，凝胶成像仪。 3.材料：拟南芥T-DNA插入突变体植株。 【实验步骤】 提取拟南芥基因组DNA 1. 在1.5ml离心管中放入2或3片拟南芥幼嫩叶片，用液氮将其研磨成细粉，向管中加入600ul预热至65℃的2×CTAB提取液，轻摇混匀。 2. 65℃水浴30 min，其间轻摇混匀。 3. 向上清液加入等体积的氯仿/异戊醇（24：1），室温下轻轻混匀10 min，12000 rpm离心15 min，再转移上清入新管。 4. 向上清液中2倍无水乙醇或等体积的异丙醇，小心混匀，-20 ℃ 下30 min，12000 rpm离心15 min，弃上清。 5. 用70%乙醇洗涤沉淀一次，12000 rpm稍离心，弃上清。 6. 将沉淀晾干，加20-50ul TE (pH 8.0)，65℃水浴30 min溶解DNA。 PCR 取3个PCR小管（一个为三引物体系，另外两个为双引物体系），按照如下反应体系向PCR小管内加入样品，设定如下反应程序，进行PCR。 反应体系： 三引物反应体系 25ul体系 双引物反