免疫原及抗血清的制备.ppt

免疫原和抗血清的制备 第一节免疫原的制备 　免疫原是能够引起机体产生抗体，并能与之发生反应的物质 一、颗粒性抗原的制备： 1.颗粒抗原指细胞抗原或细菌抗原。　　　  2.细菌抗原： H抗原　有动力的菌株　O抗原 100℃　2-2.5h　为了 破坏H抗原，获得O抗原Vi抗原 3.虫卵、细胞膜颗粒抗原呈乳浊状，多用V内免疫，较少用佐剂作皮内注射 二、可溶性抗原的制备： 组织和细胞粗抗原的制备： 1.组织和细胞混合抗原的制备：　组织匀浆制备：　标本要求：新鲜或低温（＜-40℃）保存的去除表面包膜或结缔组织或一些大血管，脏器应进行??灌注，除去血管内残留血液? 　　　　　　 制备　处理好组织→0.05％NaN3生理盐水洗净→剪成小块　粉碎→高速组织捣碎机法→2000-3000rpm离心10min?????研磨法：玻璃匀浆器,乳钵研磨?????→上清　10000-20000rpm 20-30min高速离心 2.细胞抗原的制备： 　　　　　　 细胞抗原　细胞膜蛋白抗原　　　　　细胞浆抗原　　　　　细胞核及核膜抗原粉碎：　　（1）反复冻融法　　（2）冷热交替法：适合细菌，病毒蛋白质及核酸　　（3）超声破碎法：适合于微生物和组织细胞 细菌，尤其真菌厚膜孢子难破坏　　（4）自溶法：利用组织和微生物的自身酶系　　　　需一定PH和温度动物组织cell　0-4℃　　　　　　　　微生物　　　　室温　　（5）溶菌酶法：一定PH（PH8.0），溶菌酶可专一破坏菌胞。蜗牛酶，纤维素酶消化细菌和组织cell　　（6）表面活性剂处理法  蛋白质抗原的制备和纯化： 可溶性抗原绝大部分为蛋白质 1.超速离心和梯度密度离心法： 用来分离亚细胞部分及大分子蛋白质1）差速离心：高低速交替进行。将大分子物质分离2）梯度密度离心：区带分离法，通过梯度密度来维持重力的稳定性，通常分离的悬液中的颗粒比液体重，要使之上浮，必须加入第三种成份，其密度连续或不连续升高，即所谓梯度3）第三种成份多用甘油、蔗糖氯化色，氯化铷适合于少部分大分子抗原，对于大量的中、小分子量的蛋白质抗原不适用此法 2.选择性沉淀法： 用沉淀剂或改变某些条件促使抗原成分沉淀1）核酸除去法：　　　　　　　（1）提取沉淀剂：　　　　　　　（2）核糖核酸酶降解法：用DNA或RNA酶与提取液作用30-60min（4℃），即可除去核酸2）盐析沉淀法：　　　　　　　（1）抗原的粗筛　　33-50％饱和度的硫酸铵　　　　　　　（2）提取丙种球蛋白　　主要为IgG　33-40％饱和度的硫酸铵　　　　　　　（3）抗原的浓缩3）有机溶剂沉淀法：　　　　　　　 有机溶剂多为酒精和丙酮4）水溶性非离子型聚合物沉淀法：　　　　　　　PEG+蛋白质颗粒→沉淀、复合物、蛋白质发生水的重分配分子量2000-6000PEG可用于沉淀蛋白PEG浓度不同可沉淀不同pro3-4％沉淀免疫复合物6-7％沉淀IgM　8-12％沉淀IgG　12-15%沉淀其他球蛋白　　　　　　　25％沉淀白蛋白　　 3.凝胶过滤和离子交换层析： 　1）分析筛层析又名凝胶过滤，将Ag分成大、中、小三种　　　　　　大分子较快出来，小分子因被阻留，出来较慢。根据分子量不同 2）离子交换层析：离用带离子基因的纤维素　　　　　　流动相逐步增加离子强度，蛋白质按电荷不同或量的差异分组常用DEAE纤维素（二乙基氨基乙基纤维素）　　　　　　根据pro携带电荷不同（溶液中等电点不同）　　　　　　常用于分离IgM　　　　　　因为IgM分子量大　　　　　　凝胶过滤洗脱曲线　　　 4.亲和层析： 利用生物大分子的生物学特异性，即生物分子间的具有的专一性亲和力而设计的层析技术。　　　　　　eg：Ag和Ab，酶和酶的抑制剂，酶蛋白和辅酶，激素和激素受体等其之间有特殊亲和力，可紧密结合成复合物.1）亲和层析支持物的选择：　　　常用：琼脂糖珠（Sepharose 2B、4B、6B） 　2）配体的选择：　3）抗原或抗体与支持物的结合：　　　步骤：　（1）活化支持物上的功能基因　　　溴化氛PH11　与支持物上的羟基形成氨基形成氨基甲酸酯基因　（2）交联（联接）　（3）清洗：除去未结合的pro　（4）亲和层析条件的选择： 原理：一定条件下，Ag和Ab能可逆性地结合成复合物，当条件改变（如稀酸、稀碱、浓盐、加温等）时又可将抗原抗体解离。如果将抗原或抗体固定在不溶性的载体上能从液相中专一性分出抗体或抗原。 根据这一原理，将可溶性抗原（或抗体）用化学方法偶联到不溶性载体上，当将相应的抗血