基因组学-课件-4基因组测序和序列组装.ppt

测序技术的发展 放射性同位素标记底物：灵敏度高 荧光标记物：灵敏度与分辨力，便于仪器阅读。一种碱基一种颜色（A红色，G黄色，C蓝色，T绿色） 毛细管电泳：取代聚丙烯凝胶平板电泳，96个泳道，每次可同时进行96次测序，每轮实验不到2小时，1天可完成近千次反应 光点测序pyrosequencing：无须电泳，每连接dNTP时释放1个焦磷酸，焦磷酸在磷酸化酶的作用下转换为化学能，发出光亮。每次只加入1种dNTP DNA芯片测序：将各种排列顺序的寡聚核苷酸点在芯片上，DNA分子与芯片温浴，能杂交的寡聚核苷酸都会在确定位置发出信号，获取信息进行对比组装。 2000年6月26日，美国总统克林顿(中)、塞莱拉公司董事长兼首席科学家克雷格·文特尔(左)和人类基因组计划首席科学家弗胡西斯·柯林斯(右)在华盛顿白宫参加庆祝人类基因组草图绘制成功。 实例：果蝇基因组的鸟枪法测序 第一个完全采取鸟枪法完成基因组测序的真核生物，180Mb 构建3个基因组文库，插入子长度分别为2kb、10kb、130kb 10kb长度足以覆盖果蝇基因组中大多数重复顺序，可在序列组装时找到单一顺序连接真实的重叠克隆 130kb便于大范围序列组装，有效建立全基因组的物理图框架 引导鸟枪法 构建插入片段为2kb的人类基因组质粒文库，每个克隆经双向测序可读500bp 构建第二个平均插入子为10kb的人类基因组质粒文库，经双向测获得2个端部序列 避免DNA片段丢失：任何一种载体都会因某些片段的插入，与宿主菌不兼容而不能扩增 10kb文库的构建有助于在序列组装时校正重复顺序产生的差错 重要区域的优先测序 人类疾病相关基因，功能相关的基因常常聚集在染色体的特定区域，优先选择基因富集区测序。 人类主要组织相容性复合区（human major histocompatibility complex, hMHC ），与人类免疫系统有关，6号染色体，3.6Mb，平均每16kb 1个基因，多态性最丰富的区域，有些座位等位基因成员超过200个 EST测序 mRNA可直接反转录为cDNA，易于构建cDNA文库； 获取EST的次数少，量少，一次cDNA测序就可以获得EST顺序，500bp的cDNA系列就可以鉴定其所在的基因； 无需反复检测EST顺序的准确性。 1998年底，100多万个人类EST，作为探针 浏览顺序：粗略分析初步顺序结果从中寻找基因系列。 原始序列（raw sequence）：直接从克隆载体插入子阅读的单个序列，尚未组装。 成对末端序列（ paired-end sequence ）：从任何基因组文库的克隆插入子两端读取的原始成对末段顺序 完成顺序（finished sequence ）：已完成测序的任何一个克隆或基因组的序列，它们是连续的，不含任何内部间隙，误差率少于0.01% 覆盖面（或深度，coverage/ depth）：每个核苷酸在完成测序中平均出现的次数，或者说完成序列的长度与组装的序列长度之比。 人类基因组计划 1990年10月，国际人类基因组计划正式启动，预计用15年完成。 1995年5－8月，测序染色新技术和热稳定聚合酶开发成功 ；7月，第一个基因组—流感嗜血杆菌的全序列发表，大小为1.8Mb。 1996年2月，各国科学家聚集在百慕大群岛召开会议，讨论并通过数据资源共享问题，规定此后的测序结果必须24小时之内送至公共数据库中，这就是著名的百慕大原则；10月，酿酒酵母的基因组全部测序完成；11月第一套小鼠全长cDNA测序完成。 1997年9月，大肠杆菌基因组全部测序完成，全长5Mb；同月毛细管测序仪出现。 1998年5月一批科学家在美国马里兰州成立塞莱拉基因公司（Celera），目标是投资3亿美元，到2001年绘制出完整的人体基因组图谱，与国际人类基因组计划展开竞争。  1998年10月23日，美国国家人类基因组研究所在《科学》杂志上发表声明说，人类基因组计划的全部基因测序工作将比原计划提前两年，即在2003年完成。 1998年底，完成第一个多细胞生物——线虫全基因组测序，总基因数达l 9000个以上。 1999年3月15日英国威尔科姆基金会宣布，由于科学家加快步伐，人类基因组工作草图将提前至2000年绘出 。 1999年9月中国获准加入人类基因组计划，负责测定人类基因组全部序列的1％，即3号染色体上的3000万个碱基对。中国是继美、英、日、德、法之后的第六个国际人类基因组计划参与国，也是参与该计划的唯一发展中国家。（美国承担了全部任务的54％，英国承担33％，日本为7％，法国为2.8％，德国为2.2％） 1999年12月1日，国际人类基因组计划联合研究小组宣布，他们完整地破译出人体第22对染色体的遗传密码，这是人类首次成功地完成人体染色体基因完