基于克隆测序技术的人类白细胞抗原基因高分辨率分型方法的建立.docx

第 42 卷 2014 年 11 月 分析化学 (FENXI HUAXUE) 研究报告 Chinese Journal of Analytical Chemistry 第 11 期 1574 ～ 1579 DOI: 10．11895 / j．issn．0253-3820．140494 基于克隆测序技术的人类白细胞抗原 基因高分辨率分型方法的建立 邢晓清1，2 初亚男2 项 铮1，2 宋沁馨* 1，2 周国华1，2 1( 药物质量与安全预警教育部重点实验室，中国药科大学，南京 210009) 2( 南京军区南京总医院药理科，南京 210002) 摘 要 运用优化的扩增和克隆测序技术，建立了人类白细胞抗原( HLA-B) 基因的高分辨率分型方法。针 对 HLA-B 基因保守区序列设计引物进行等位基因扩增，基于质粒不相容原理将杂合型等位基因有效克隆入 质粒 DNA 中，经细菌培养后进行 Sanger 测序，根据测序结果经 ClustalX2 软件分析和 IMTG / HLA 数据库的 BLAST 比对即可完成 HLA-B 基因的高分辨率分型。利用建立的方法对 7 例临床样本进行了 HLA-B 基因分 型，并且与第三方直接碱基序列分析基因分型技术( PCＲ-SBT) 进行比对，结果完全一致。本方法无需专业分 型软件，准确度高，成本低; 采用通用引物进行等位基因的扩增和测序，无需传统方法中繁琐的引物设计和过 程优化，实现了 HLA-B 基因的高分辨率分型。 关键词 人类白细胞抗原-B 基因; 克隆测序技术; Sanger 测序; 高分辨率基因分型 1 引 言 人类白细胞抗原( Human leukocyte antigen，HLA) 是由一系列紧密连锁的基因座位所组成的具有高 度多态性的复合体，是机体免疫系统的重要组成部分，在机体的抗原呈递和免疫应答中发挥重要作用， 与人类疾病的发生、发展和预后密切相关。HLA-B 基因位于 6 号染色体短臂 6p21．3 区域，该基因的多 态性非常复杂且主要位于第 2 和第 3 号外显子，第 2 和第 3 号外显子的总长度约 550 bp 左右，目前已发 现的近千种基因型绝大多数是基于第 2 和第 3 号外显子的多态性进行分型的。 研究发现，HLA-B 基因与药物不良反应密切相关。例如，卡马西平为广谱抗癫痫药物，已广泛用于 治疗精神疾病，但部分病人服用该药后会出现毒性副作用 SJS / TEN( Steven-Johnson 综合征 / 中毒性表皮 坏死松解症) ，严重时会导致死亡。由于 HLA-B* 1502 等位基因与卡马西平诱导的 SJS / TEN 密切相关， 2007 年 12 月美国食品药品监督管理局发布通知，告诫 HLA-B* 1502 等位基因阳性者服用卡马西平可 能发生严重和潜在致命的皮肤反应，并推荐患者开始使用卡马西平前，需进行血液基因筛查; 2011 年， Chen 等［1］发表了对台湾 4877 例大样本研究的结果，进一步证明 HLA-B* 1502 基因的检测可以显著降 低由卡马西平引起的 SJS / TEN 发病率。又如，别嘌呤醇是临床上治疗慢性原发性和继发性痛风的药物， Somkrua 等［2］对 HLA-B* 5801 基因与别嘌呤醇诱导的 SJS / TEN 的进行了 Meta 分析，表明两者存在明显的 相关性。再如，阿巴卡韦是治疗艾滋病的药物，Mallal 等［3］发现 HLA-B* 5701 等位基因的筛查能够减少药 物阿巴卡韦诱导的皮肤超敏事件的发生。随着 HLA-B 基因与临床治疗之间联系的研究深入，HLA-B 基因 型的检测将越来越重要，对指导临床用药具有重要意义，可以减少临床用药不良反应的发生。 应用聚合酶链式反应( Polymerase chain reaction，PCＲ) 扩增出相应的等位基因，采用质粒不相容原 理的克隆测序技术可将杂合型等位基因分离，获得单倍体型的基因信息，常用于新等位基因的确认、基 因序列的获得和多态性分析［4 ～ 6］。克隆测序技术应用于 HLA 基因已有报道，如邓志辉等［5，6］应用克隆 测序技术成功进行了 HLA-CW 和 HLA-DＲB1 等基因全长序列的测序，并分析 HLA 基因多态性，但是目前 没有关于克隆测序技术进行 HLA-B 基因分型并应用于临床的报道。本研究在克隆测序原理的基础上进 一步优化分型条件，仅使用一对扩增引物和一对测序引物即完成了 HLA-B 基因的高分辨率分型，既满足 2014-06-07 收稿; 2014-08-18 接受 本文系江苏省科技支撑计划社会发展项目( No．BE2012744) ; 中国博士后科学基金面上项目( No．2012M512179) ; 药物