基因工程表达载体cmx.ppt

10 10 EcoR I Pst I ATG TAG Sal I Sma I 题2 克隆表达 37℃,1h 37℃,1h Vector Gene 14 ℃, 6h or overnight, then store at -20 ℃ Protocol Cell 37℃, 45min Transform Protocol 37℃, 16-20h PCR, Sequence, Express 30-32℃,200rpm,OD600=0.4-0.8 42℃，200r/min,3-5h 37℃,200rpm, OD600=0.4-0.8 42℃,200rpm, 3-5h purification Protocol pGEX-6P-3 肠激酶 37℃,1h 37℃,1h Vector Gene 14 ℃, 6h or overnight, then store at -20 ℃ Protocol Cell 37℃, 45min Transform Protocol 37℃, 16-20h PCR, Sequence, Express 37℃,200rpm,OD600=0.4-0.8 IPTG(1 mmol / L)，200r/min,3-5h 37℃,200rpm, OD600=0.4-0.8 IPTG(1 mmol / L)，200r/min,3-5h purification Protocol 克隆 筛选转化子 （酶切、PCR、杂交） 小量表达 （活性、特异性检测） 大量表达 分离纯化 功能、应用 思考题 大肠杆菌表达载体比克隆载体多了哪些功能元件，各有什么生物学功能？ T7噬菌体启动子的表达载体是如何控制渗漏表达？ OVer!!!! 启动子对宿主菌的要求：有过量表达的lacI（菌体染色体突变成lacIq，载体上增加lac I基因）。Lac表达系统存在的问题：IPTG有毒，所以医药和食品不能用，可用温度敏感调控或乳糖诱导。但乳糖诱导受影响的因素很多，其诱导剂量要高于IPTG。但乳糖会影响细菌生长，所以发酵工艺研究是必须考虑乳糖因素的。 PL,PR是噬菌体早起起始转录的启动子，其转录与否决定噬菌体是进入裂解循环或溶源循环。其转录受到cI基因产物阻遏。但cI基因的表达收到宿主等一系列因子的影响错综复杂，根本无法调控。因此选用温度敏感突变体进行调控。普通细菌没有cI基因，表达不稳定。所以采用宿主菌溶源菌，或直接将cI基因组装在载体上。不填加化学试剂诱导，便宜无毒，最初相对好用。但是热脉冲会使得 细胞产生很多热诱导蛋白，其中包括蛋白酶。而且从30度提高到40度需要时间，诱导效果受到限制。 专一性非常强的表达体系。T7RNA聚合酶活性高，是大肠杆菌的5倍左右。有些不能被大肠杆菌有效转录的，可以选此启动子。在细胞内大肠杆菌RNA聚合酶竞争不过T7的，最终被控制。 高效表达，难免引起基础水平表达较高，因此引入了低水平表达体系的溶菌酶，可以抑制T7RNA聚合酶的活性。 翻译启动效率由5‘段的RBS决定。SD序列与AUG（少数GUG或UUG），及其之间的距离和碱基组成都会影响表达效果。7个碱基效果很理想。 在强启动子的控制下，容易引起转录过头或通读现象。是的mRNA长度不一，影响外援基因的表达。影响细菌的复制、浪费甚至使得蛋白无法正确折叠。强终止子有大肠杆菌rRNA基因的rrnT1T2，和T7的Tfai。 谷胱苷肽巯基转移酶与目的基因产物的融合体，即融合蛋白，具有酶的活性。 p90 组成成分： 含有启动子(tac)及lac操纵基因、 SD序列 谷胱苷肽巯基转移酶(GST)基因，蛋白酶切割位点序列，克隆的外源基因则与GST基因及蛋白酶切割位点相连。 pGEX-6P-3 肠激酶 该载体具有以下优点： ①可诱导，能高效表达所需基因或基因片段。IPTG可诱导tac启动子进行高效表达。 ②融合蛋白极易纯化。谷胱苷肽巯基转移酶GST分子量为25kDa，作为一种酶在大肠杆菌表达或与外源基因融合表达时，与自然界存在的酶具有相同的酶活性，用亲和层析法(G1utathione Sepharose 4B)极易从裂解液中分离纯化出融合蛋白，也可用显色法或免疫学方法方便地检测外源蛋白的表达量。 P90倒数2段 该载体具有以下优点： ③可方便地从融合蛋白中获取单一外源蛋白。在pGEX多克隆位点上游有一个位点特异的蛋白酶(如凝血酶、prescission protease，Factor Xa)识别和切割位点，可方便地将所需蛋白从融合蛋白中切出并纯化。所以，近年来该系统已广泛地应用于基因表达、分子免疫学、疫苗生产及DNA蛋白质相互作用的研究等。 pGEX-6P-3 肠激酶 凝血酶 Xa 因子 肠激酶 （4）6×H