第六章 微生物菌种的选育.ppt

注： 如果是协同反馈抑制，则要在基本培养基中添加起协同反馈抑制作用的产物 抗结构类似物突变是数量性状，可通过逐渐提高结构类似物的浓度使产物的积累水平逐渐提高 抗结构类似物突变和营养缺陷型突变等共同使用，提高产量的效果会更好。 结构类似物和代谢终产物 终产物 结构类似物 过量积累产物 精氨酸 D-精氨酸 精氨酸 苯丙氨酸 对氟苯丙氨酸,噻吩丙氨酸 苯丙氨酸 赖氨酸 AEC 赖氨酸 酪氨酸 对氟苯丙氨酸,D-酪氨酸 酪氨酸 色氨酸 5-碱基色氨酸,6-甲基色氨酸 色氨酸 脯氨酸 3,4-二氢脯氨酸,磺胺胍 脯氨酸 腺苷酸 2-氟腺嘌呤 腺苷酸 葡萄糖 2-脱氧葡萄糖 b-葡萄糖苷酶 蔗糖,麦芽糖 2-脱氧棉子糖 蔗糖酶 纤维二糖,葡萄糖 甘油 纤维素酶 （三）组成型突变株的筛选及应用 组成型突变株：在没有诱导底物存在时也能产生大量诱导酶的突变株。 筛选原理：通过诱变处理，使调节基因发生突变，不产生有活性的阻遏蛋白，或者操纵基因发生突变不再能与阻遏物相结合，从而使诱导型酶变为组成型酶。 筛选方法： 创造一种有利于组成型菌株生长而不利于诱导型菌株生长的培养条件，造成对组成型突变株的选择优势； 选择适当的鉴别培养基，直接在平板上识别两类菌落，从而把组成型突变株选择出来。 （四）细胞膜透性突变型 提高细胞膜透性的优点 使胞内产物浓度维持较低的水平，有利于酶促反应的进行，提高产物的生成量 使胞内产物浓度维持低于发生反馈抑制或阻遏的程度，以积累过量的产物 提高细胞膜透性 的措施 例1：谷氨酸生产 生物素对于细胞膜（脂肪酸）的合成是必需的 筛选Bio-，在限量添加生物素的情况下可使合成的谷氨酸大量分泌到胞外，使谷氨酸得以过量积累 例2：5’-肌苷酸生产 Ade-可以合成5’-肌苷酸，但不能分泌到胞外 在限量Mn2+(10mg/L）时，可以分泌 选育Mn2+浓度（100mg/L)不敏感突变株，能在过量Mn2+的培养基中正常分泌5’-肌苷酸，达到过量积累的目的 X-射线的照射剂量与亚热带链霉菌白霉素高产菌株39#变异的关系 形态突变型 负突变型 正突变型 紫外线照射剂量与龟裂链霉菌土霉素高产菌株293#变异的关系 3. 处理方法 单一诱变剂处理; 复合处理：两种或两种以上诱变剂同时处理、不同的诱变剂交替处理、同一诱变剂连续处理以及紫外线与光复活交替处理等( 注意！) 乙烯亚胺与紫外线复合诱变处理结果 1- 对照； 2-乙烯亚胺（浓度1:7000）； 3, 5, 7, 9-紫外线； 4, 6, 8, 10-乙烯亚胺加紫外线 紫外线的剂量（erg/mm2）： 3, 4-2000；5, 6-4000； 7, 8-6000；9, 10-10000 3. 处理方法 直接处理：在缓冲液或无菌生理盐水体系中对出发菌株进行诱变处理，然后涂平板分离突变株； 生长过程处理：在摇瓶培养基或固体平板中加入诱变剂，在菌体生长时进行诱变处理。（适用？） （五）后培养 后培养：将诱变处理过的细胞在营养丰富的培养基中进行培养，使突变基因稳定、纯合并表达。 目的：消除表型延迟 后培养培养基：营养要求丰富，酪素水解液(或蛋白胨)可提供大量氨基酸，酵母膏可提供各种生长因子。 （六）变异菌株的分离及筛选 1.变异株的分离：多为平板分离，结合快速检出法（平板预筛） 根据形态变异淘汰低产菌株或筛选高产菌株； 根据平皿反应淘汰低产菌株或直接挑取高产菌株 2.筛选：包括初筛，复筛和终筛等。 明确筛选目标：产量突变还是其它突变型；产量准备提高多少等； 一次诱变目标不要太高。 制定筛选方案：筛选准备分几步；筛选采用的培养方法和培养条件；每一步准备筛选多少菌株；每一步准备采用的分析方法等。 制定筛选方案时的一些基本原则 筛选菌株的量要根据实验室的人力物力条件而定； 初筛的目的是将大多数未变异菌株或负变菌株去除，这时解决的主要是量的问题，因此每株菌培养时一般只在一种培养条件下培养一瓶；培养条件一般沿用出发菌株的培养条件，分析方法也选用适于处理大量样本的、操作简便而快速的方法，如HPLC, GC，比色法等（分析方法的精确性可以稍差一些）。 复筛时量的矛盾已不突出，而对准确性有了更高的要求，因此复筛一般要培养2~3瓶，分析方法一般选用经典方法或标准方法，有时要进行几次复筛。 筛选的一般步骤 1株出发菌株 ↓诱变处理 400个单细胞菌株 ↓初筛每株1瓶 80株 ↓复筛每株三瓶 16株 ↓复筛，三种工艺条件，每株各三瓶 3株（对应于不同工艺条件） ↓ 供生产或再次诱变使用 （七）诱变育种工作中应注意的问题 安全问题：各种诱变剂几乎都有致癌作用，因此在操作中应时刻注意安全问题：个人安全和环境安全。 个人安全：操作时注意防护，不同诱变剂要求不同防护方法，如γ-射线辐射