第三章细胞培养的本方法.ppt

三.污染的预防 防止污染，预防是关键。 1）、培养操作前的准备 超净台保持清洁； 使用消毒后的器皿。 2）、培养操作时的注意事项 见无菌操作的注意事项。 四、污染的排除 1、使用抗生素； 2、加温处理； 3、动物体内接种除菌法； 4、巨噬细胞吞噬法 思考题 1、细胞培养时如何预防污染？ 2、列举无菌操作的注意事项。 六、 培养细胞的取材 取材组织用培养液浸泡，4度运送，24h内尽快培养。 取材无菌操作，避免对组织的机械损伤，尽量去除脂肪、神经、结缔、坏死组织，污染组织可用青链霉素和制霉菌素漂洗。 原代取材同时保留组织学和电镜标本，对供体来源、部位及一般情况做记录。 欲从组织中获得大量生长良好的细胞，须将组织分散开，使细胞解离出来。 常用方法有机械法和化学法。 第二节 培养细胞的观察 组织块培养法 将组织剪成小块后，接种于培养瓶，24小时贴壁后，细胞就从组织周围长出。 培养瓶底预先涂以胶原薄层，以利上皮细胞的生长。 如需做组织染色或电镜检查，可将组织可放入小盖玻片上后再放进培养瓶培养。 换液需轻巧，以免组织块漂起，细胞死亡 消化培养法 采用前述的组织消化分散法。将妨碍细胞生长的细胞间质去除，使细胞分散，形成悬液，按不同浓度接种培养瓶培养。 密度抑制（Density inhibition）或接触抑制（Ccontact inhibition） 1958年Abercrombie 等学者提出的一种现象，培养细胞再生长过程中多发生分裂增殖，细胞移动而相互靠近，这时某些细胞可移向其他方向，保证细胞不会重叠，一但接触，这种活动即可停止。 所谓接触抑制实际使细胞汇合形成单层时，细胞变得拥挤，与培养液接触的表面区域也相应减少，营养成分消耗，其分裂也将停止。 培养细胞的生长过程 1） 原代（初代）培养期：从机体取下组织培养到第一次传代，此代细胞保持异质性，细胞种类较多，接近原组织细胞种类。维持时间，因细胞种类不同，一般1-4周。 2） 传代期培养：初代培养的细胞生长到一定程度，即可连接传代，使其连续生长。 一般正常二倍体细胞，不加附加条件，可传代30-50代，此时可发生染色体丢失、突变、细胞增殖变慢、停止分裂，进入衰退期，我们称之有限细胞系。这一转折点有人称之危象临界点（crisis） 有些细胞的少数后代，或通过人工条件转化的细胞可通过这一期，获得持久的增殖传代能力，我们称细胞系，或无限细胞系，即一般通称的细胞系。 （3） 衰退期：传代细胞到达一定代数，即发生增殖缓慢，逐渐停止，进而发生衰退、死亡，多数传代细胞（或叫有限细胞系），不能通过所谓的“crisis（危象临界点），导致最终死亡，这一现象可能说明生物学衰老的细胞学基础。 人胚胎成纤维细胞可以进行60代增殖，而80岁老人的肺成纤维细胞仅传代了16代后便死亡。表皮细胞寿命4-10天；红细胞3周-3个月，白细胞5-7天，神经细胞数年或更多。 实体显微镜（解剖镜） 倒置显微镜 生物显微镜 照相设备 对培养材料进行细胞学鉴定和研究 2、显微镜观察 3、细胞计数法（cell counting） 用血细胞计数板计数细胞悬液中的细胞数目，以测定细胞增殖和调整细胞浓度的一种方法。 4、细胞生长曲线（cell growth curve） 是观察细胞在一代生存期内的增生过程的重要指标。 横坐标为培养时间 纵坐标为细胞密度 注意：只有具备自身稳定生长特性的细胞才适合观察。 细胞生长曲线 细 胞 数 量 生长天数 缓慢生长期 对 数 生 长 期 平 衡 期 （1） 迟缓期（或延迟期） 当细胞接种到培养瓶后，细胞逐渐贴附于瓶底，并恢复贴壁形状，代谢开始旺盛，出现细胞分裂及增殖，但生长缓慢。 （2） 对数生长期：此期几乎所有的细胞都在进行分裂，细胞数目迅速增长。其细胞倍增时间（TD）等于细胞周期时间（TC）长度。这一期常用细胞倍增时间及细胞分裂指数来判定。 （3） 平衡期（平坦期）这期细胞数目虽然在增加，但其增加速度在减慢，直至细胞数量不再增加，处于平衡状态。 5、细胞分裂指数 指分裂期细胞在全部细胞中所占的百分率，用以表示细胞的增殖旺盛程度。一般要计算和观察1000个细胞中的细胞分裂相数。 6、细胞贴壁率 细胞贴壁率又称接种存活率，用于观察贴壁附着生长细胞，主要反映细胞的生存能力和部分底物材料的相容性。 7、细胞周期 细胞周期：一个细胞的分裂生长周期时 间。 倍增时间：指在对数生长期细胞数量增加一倍所用的时间，这一时间内一般有些