分子杂交和印迹技术.ppt

基本方法 将DNA标本用限制性内切酶消化后，经琼脂糖凝胶电泳分离各酶解片段； 经碱变性，Tris缓冲液中和，高盐下通过电转移将DNA从凝胶中转印至硝酸纤维素滤膜上，烘干固定，凝胶中DNA片段的相对位置在DNA片段转移到滤膜的过程中继续保持着。 附着在滤膜上的DNA与32P标记的探针杂交，利用放射自显影术确定探针互补的每条DNA带的位置，确定在众多酶解产物中含某一特定序列的DNA片段的位置和大小。 Southern 杂交的主要步骤 待测DNA样品的制备、酶切 待测DNA 样品的电泳分离：琼脂糖凝胶电泳 凝胶中DNA的变性：碱变性 Southern转膜： 硝酸纤维素(NC)膜、尼龙膜 毛细管虹吸印迹法、电转印法、真空转移法 探针的制备 Southern杂交 杂交结果的检测 Northern 印迹杂交(Northern bloting) 检测RNA（主要是mRNA）的方法 与Southern杂交的不同 靶核酸：RNA RNA电泳 转膜：不需变性 Western 杂交印迹法(Western bloting) 检测蛋白质，即将电泳分离的非标记蛋白质转移到固相载体上，用特异的抗血清对蛋白质进行鉴定及定量的方法 主要步骤： 蛋白质样品的制备 聚丙烯酰胺凝胶 蛋白质的电转移：尼龙膜 靶蛋白的免疫学检测 靶蛋白于第一抗体（一抗）反应 与标记的第二抗体（酶标二抗）反应 显色反应：酶促反应 原位杂交(in situ hybridization) 将标记的核酸探针与细胞或组织中的核酸进行杂交，称为原位杂交。 特点 能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究 不需从组织或细胞中提取核酸，对含量极低的靶序列灵敏度高 能准确反映组织细胞的相互关系及功能状态 核酸原位杂交的基本步骤 细胞或组织的固定：载玻片 组织细胞杂交前的预处理 用去垢剂或蛋白酶除去核酸表面蛋白质 探针的选择和标记 杂交 杂交结果检测 FISH（fluorescence in situ hybridization）技术是一种重要的非放射性原位杂交技术。它的基本原理是:如果被检测的染色体或靶DNA与所用的核酸探针是同源互补的，二者经变性-退火-复性，即可形成靶DNA与核酸探针的杂交体。 将核酸探针的某一种核苷酸标记上报告分子如生物素、地高辛，可利用该报告分子与荧光素标记的特异亲和素之间的免疫化学反应，经荧光检测体系在镜下对待测DNA进行定性、定量或相对定位分析。 探针的标记 探针的种类 cDNA 探针、基因组DNA探针、寡核苷酸探针、RNA探针 标记物 核素标记物（同位素标记）：32P、35S、3H等 非核素标记物（非同位素标记）：生物素、地高辛、荧光素等 探针标记方法 缺口平移法(nick translation) 随机引物法(random primer)：六核苷酸残基的引物 PCR标记法 末端标记法 探针的纯化 常用DNA和蛋白质相互作用的研究技术: DNA凝胶阻滞试验 DNase Ⅰ足迹试验 DNA迁移率变动试验(DNA mobility shift assay)，又叫凝胶阻滞试验，是一种体外研究DNA与蛋白质相互作用的特殊凝胶电泳技术. 基本原理为: 在凝胶电泳中，由于电场的作用，小分子DNA片段比其结合了蛋白质的DNA片段向阳极移动的速度快，因此，可标记短的双链DNA片段，将其与蛋白质混合，对混合物进行凝胶电泳。若目的DNA与特异性蛋白质结合，其向阳极移动的速度受到阻滞，对凝胶进行放射性自显影，就可找到DNA结合蛋白 . DNase Ⅰ足迹试验: 足迹试验不仅能找到与特异性DNA结合的目标蛋白，而且能告知目标蛋白结合在哪些碱基部位，基本原理是蛋白结合在DNA片段上，保护结合部位不被DNase破坏，这样，蛋白质在DNA片段上留下了“足迹”，在电泳凝胶的放射性自显影图片上，相应于蛋白质结合的部位没有放射性标记条带. 表达序列标签技术（EST，Expressed Sequence Tags） : 此技术以大规模cDNA测序为基础，即提取生物体的mRNA，进一步获得cDNA文库，挑选其中300—500bp的部分（即EST序列）进行序列测定，然后通过生物信息学手段得到全长的基因序列。通常EST序列位于一段cDNA的3’—端非翻译区，也可以在该cDNA中随机选取。利用EST技术克隆基因及功能分析，使克隆和定位新基因的策略发生了巨大变革。 基因打靶技术是一种定向改变生物活体遗传信息的实验手段，它的产生和发展建立在胚胎干细胞技术(ES)和同源重组技术的基础之上，首先获得ES细胞系，利用同源重组技术获得带有研究者预先设计突变的靶ES细胞。通过显微注射或者胚胎融合的方法将经过遗传修饰的ES细胞引入受体胚胎内。 经过遗传修饰的ES细胞仍然保持分化的全能性，可以发育为嵌合体动物的生