分子克隆和蛋白纯化.ppt

分子克隆和蛋白纯化的概况 主要工作 载体构建 蛋白分离与纯化 蛋白结晶 晶体衍射和数据分析（结构解析） 一.载体构建 也就是基因重组技术，主要包括： 目的基因的获取 克隆载体的选择 外源基因与载体的连接 重组DNA导入受体菌 重组体的筛选 克隆基因的表达 1.目的基因的获取 化学合成法 已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列 。 基因组DNA文库 cDNA文库 PCR 2.克隆载体的选择 选择克隆载体的几个重要参数 1）实验对象 (供体和受体) 2）实验性质（实验的目的） 3）载体容量 （M13mp载体 细菌质粒载体 10kbλ载cos质粒载体pYAC载体∽1000 kb） 4）合适克隆位点 5）载体的稳定性 6）载体DNA制备的难易 7）外源基因表达产物产量、产物特点等 3.外源基因与载体的连接 最常用的是粘性末端连接同一限制酶切位点连接，要考虑以下三个方面： 载体总量， 载体和插入片段比例， 载体和插入片段质量。 4.重组DNA导入受体菌 我们使用的是转化的方式，受体菌处于感受态。 要注意的是复苏的LB培养基必须无菌而且没有抗生素 5.重组体的筛选 提质粒，酶切或PCR验证； 菌液PCR； 测序。 6.克隆基因的表达  我们用试表达的方法来验证是否构建成功。 如果重组克隆能在宿主菌中表达，就可以用特异的蛋白质抗体为探针，进行原位杂交，选择特异的克隆。 二.蛋白分离与纯化 我们主要研究膜蛋白，由于它表达量少，不溶于水溶液，这就增加了工作的难度。即使使用E.coli过表达也很难满足研究的需要。不溶于水，使用去污剂来维持它的稳定性，工作难度成指数级增加。 主要内容 大批量的培养细菌和收菌； 细胞破碎和膜沉淀； 溶膜（用去污剂将膜蛋白从膜中提取出来）； 膜蛋白纯化。 大批量的培养细菌和收菌 使用已转化的表达系进行蛋白的过量表达，在培养基中添加相应的抗生素和诱导剂。诱导在稳定期进行（大约在5~6h），诱导后3h就可以收菌了。 细胞破碎和膜沉淀 使用超声破碎的方法将细胞破碎，结合冻融的方法效果会更好。如果超声破碎不充分，大量的DNA会使溶液很粘稠，将会影响到蛋白的纯度。细胞破碎后要立即进行膜沉淀，将膜分离出来。 溶膜 这是膜蛋白研究工作中最关键的一步，根据自己蛋白的性质选择合适的去污剂是实验成功的关键。本质上就是用去污剂去置换膜上包裹蛋白的磷脂。 膜蛋白纯化 我们表达的蛋白是加了His-tag的，这就是纯化变得很方便，应用Ｎｉ２＋可以吸附组氨酸的咪唑基团而将目的蛋白分离出来。 　在所有的纯化过程中，去污剂的浓度都要高于ＣＭＣ（ｃｒｉｔｉｃａｌ　ｍｉｃｅｌｌａｒ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ） 　在纯化过程中的ｂｕｆｆｅｒ添加５％的甘油可以提高膜蛋白的稳定性。 　使用离子交换色谱和凝胶色谱可以获得很纯的蛋白。 三．蛋白结晶 　　　我们的目的就是要拿到晶体，而且还是要分辨率高的晶。这是一个很难掌握的一步，就像是在大海捞针一样，使用不同的ＫＩＴ和不同的去污剂进行大量的筛选，如果幸运的话，某个条件有晶体出现，就要在这个条件下进行优化，包括盐浓度，缓冲液和ＰＨ。 　蛋白结晶是整个研究的瓶颈，这时ＲＰ值就显的特别重要。 四．解结构 　　将晶体进行x射线衍射，收集衍射图谱，通过一系列的计算，很快就能得到蛋白质的原子结构。