第七章 高等动物因1 哺乳动物表达系统.ppt

基因治疗 第一节 高等动物基因工程的基本概念 D 哺乳动物表达系统的基因转移方法 （1）病毒类载体 * * 1. 添加Kozak序列 Kozak系统分析了mRNA的5′端的序列与翻译效率的关系。结果表明：最有效的翻译起始的共有序列是5′－ CCA/GCCATGG－3′(划线的为起始密码子) ，而且最重要的是－3位的嘌呤，其次是+ 4 位的G. 实验表明： 具有Kozak 序列与否将使翻译起始的差异在一个数量级。 内部核糖体进入位点（IRES ）是从细小RNA 病毒中发现的，由它连接的开放阅读框架可以同时翻译。IRES 序列被广泛应用于构建双顺反子或多顺反子哺乳动物细胞表达载体。 用IRES 构建多个顺反子表达载体， 可以表达多亚基蛋白。 2. 通过 IRES 表达多亚基蛋白 3. 通过翻译增强子提高翻译效率 翻译增强子是具有与 IRES 不同二级结构的另一类提高翻译起始效率的顺式调控元件。1998 年stein 等发现在组织缺氧情况下 VEGF mRNA寿命大为提高。 VEGF 翻译增强的程度可高达40 倍，由此发现了翻译增强子。 （1) 利用密码子的偏好性 根据密码子的偏好性，在不改变蛋白质编码序列的前提下尽量使用CHO细胞常用的密码子对基因进行改造 实例：Kim 等用人高表达基因偏爱的密码子系统地设计了人的EPO 基因， 再以酵母偏爱的密码子编码人的EPO基因作对照来比较优化后的人EPO 基因的表达效率。结果表明，优化的人EPO 基因密码子比非优化的人EPO 基因密码子的表达效率高2－3 倍。 二、基因改造 （2) 尽量使用基因组DNA 基因组DNA 比cDNA 表达量要高。 因此，在可能的条件下，尽量使用基因组DNA。 若用cDNA，则尽量切除cDNA中的不必要序列，一方面降低转录、翻译时不必要的能量消耗，另一方面减少5′未翻译前导区和克隆中的GC 尾部对表达水平的不良影响。 三、宿主改造 （1）增强 CHO 细胞抗细胞凋亡活性； （2）使 CHO 细胞可在无血清培养基（PFM） 中自分泌生长； （3）减少 CHO 细胞中有害代谢物的产生； （4）控制 CHO 细胞增殖速率； 迄今为止，已有大约300种重组蛋白药物正在进行临床试验，但 在哺乳动物工程细胞中大规模生产的只有少数几种： b 干扰素 g 干扰素 凝血因子VIII 凝血因子IX 促红细胞生成素（EPO） 人生长因子（hGH） 白介素 2（IL-2） 乙型肝炎表面抗原 单克隆抗体 CD4受体 组织型纤溶酶原激活剂（tPA） （2）利用哺乳动物工程细胞生产重组蛋白的实例 1. 利用哺乳动物工程细胞生产人源化的小鼠抗体 大多数恶性淋巴 Neor 鼠金属硫蛋白启动子 b 肌动蛋白启动子 抗体轻链cDNA b 肌动蛋白终止子 pL dhfr SV40启动子 b 肌动蛋白启动子 抗体重链cDNA b 肌动蛋白终止子 pH 瘤细胞表面上都 有一种特异性的 糖蛋白campath， 用人源化的小鼠 抗campath抗体 治疗非霍杰金淋巴 细胞瘤患者，效 果良好。重组抗 体采用DHFR-M TX系统表达。 2. 利用哺乳动物工程细胞生产人组织纤溶酶原激活剂 第一个由重组哺乳动物 dhfr 启动子 人tPA cDNA 终止子 细胞规模化生产的医用蛋白 是治疗急性心肌梗塞的溶血 栓药物：人组织纤溶酶原激 活剂（tPA）。同样采用 DHFR-MTX系统表达，受体 细胞选用CHO系统。目前， 用该工艺路线生产的重组人tPA已经商品化。 信号肽编码序列 此外，人tPA也可由重组大肠杆菌生产，但蛋白的重折叠效率低。 t-PA 的二级结构 3. 利用哺乳动物工程细胞生产人凝血因子VIII 凝血因子VIII编码基因的缺陷与血友病密切相关。多年来，血友病 病人都是使用从人血中分离纯化的凝血因子VIII生物制品进行治疗，然 而由于人的血源污染乙肝病毒或爱滋病病毒，数千名使用这种血液制 品的血友病人惨遭感染，其中10%的病人最终死于爱滋病而非血友病。 早在上述情况发生之前，人凝血因子VIII的cDNA便已被克隆和鉴 定，血源的污染则加速了利用基因工程技术生产该药物的进程。与tPA 相似，人凝血因子VIII也是一种结构复杂的大分子，必须通过重组哺乳 动物细胞生产，但目前商品化了的重组人凝血因子VIII尚不能满足几代 血友病人的大量需求。 From Gene to Drug Product Purification Thaw Cell Culture Formulation Gene Cell (3)