第四章-2基因工程.ppt

——目的基因的克隆与基因文库的构建 一般来说，目的基因的克隆战略分为两大类： 一类是构建感兴趣的生物个体的基因文库，即将某生物体的全基因组分段克隆，然后建立合适的筛选模型从基因组文库中挑出含有目的基因的重组克隆； 另一类是利用PCR扩增技术甚至化学合成法体外直接合成目的基因，然后将之克隆表达。 A 鸟枪法 B cDNA法 C PCR法 D 化学合成法 E 基因文库的构建 The end ! 应用mRNA差别显示技术（DDRT-PCR） 分离克隆的目的基因 (differential display reverse transcription polymerase chain reaction) 原理： 用3 ’-端锚定引物和反转录酶合成cDNA的第一链；用3 ’-端锚定引物和5’-端10-mer随机引物组成引物对，以反转录第一链为模板进行PCR扩增（DDRT-PCR），在标准的序列胶中电泳2~3小时，可显示出50~100条长度在100~5000bp之间的DNA条带。 3 ’-锚定引物： P.Liang等人设计合成了全部12种不同的引物，用以反转录mRNA，合成第一链cDNA。这种引物通常叫作3-端锚定脱氧核苷酸引物，并用5-T11MN或5-T12MN通式表示。其中M为除了T以外的任何一种核苷酸（即A、G或C），而N则为任何一种核苷酸（即A、G、C或T），故MN共有12种不同的排列组合方式。 mRNA: 5’-NMAAAAAA…AA-3’(12种序列) 3’-NMTTTTTTT…TT-5’ 5’-随机引物： 10-mer，更好的同第一链结合，从而呈现出更多种的mRNA。一般用20种随机引物和12种3’-端锚定引物组成的全部240组引物对PCR扩增后，所产生的大约20 000条条带，基本涵盖了在一定的发育阶段某种类型细胞中所表达的全部的mRNA。 DDRT-PCR（mRNA differential disply reverse transcription polymerase chain reaction） 由于在cDNA群体中，代表特定细胞类型或发育阶段的mRNA的含量非常低，所以要把一种只在某一阶段或某种细胞类型中表达、而在另一发育阶段或某种细胞类型中不表达的目的基因分离出来，就需要PCR扩增。 基本过程： 1. 从一对处于不同发育阶段（或不同基因型） 的细胞群体中分离总mRNA，并用3’-端锚定引物作反转录合成第一链cDNA; 2.用5’-端随机引物和3’-端锚定引物组成的引物对，在加入放射性同位素标记的dNTP的条件下，以第一步反转录产物作模板进行PCR扩增。 3.将扩增样品在变性的DNA测序胶中进行电泳分离； 4.将有关的差别表达的DNA条带从测序胶上切割下来回收其DNA片断； 5.胶块中的DNA量非常少，不能用于克隆，需进行二次扩增； 6.将克隆的特定的DNA分别同基因组DNA及总mRNA作Southern或Northern杂交，测序； 7.以此目的片断作探针从cDNA文库中或基因组文库中筛选全长的cDNA克隆或基因组克隆。 优点： 1.可以同时比较多个样品表达的差异； 2.可以同时检测“上游”及“下游”的基因； 3.检测灵敏度高，所需样品少，经PCR扩增一些低峰度的mRNA也可以被检测出来； 4.结合使用了PCR和序列胶电泳分析两项技术，使本方法显得较单方便。 局限性： 1.假阳性比例高（50%～75%）； 同一长度的条带，含有多种DNA序列；邻近条带回收时，造成人为误差； mRNA3’-端序列保守性高，而常用3’-端cDNA作探针。 2.扩增的差别条带分子长度比较短小（110～450bp）； 应用表达文库 分离克隆的目的基因 表达文库分离克隆的目的基因 当没有可用的核苷酸序列供作筛选基因文库的探针时，将cDNA克隆在表达载体上，再导入大肠杆菌寄主细胞然后通过对蛋白质产物的鉴定，分离克隆的真核目的基因。 特点： 1.表达的蛋白质以融合蛋白质的形式存在，其中原核蛋白质的氨基酸序列是整合在真核蛋白质的一个末端，不易被原核细胞中的有关蛋白酶消化降解，因而显得比较稳定，可以得到较高的表达水平。 2. cDNA片断必须置于启动子序列下游，在其控制之下；按正确的取向和读码结构插入，确保产生正确的蛋白质。 筛选的方法： 1. 利用抗体筛选表达文库； 2. 测定蛋白质的功能；