核酸提取及常见 问题 分析.ppt

核酸提取 及常见问题分析 TIANGEN BIOTECH(BEIJING) CO., LTD. DNA提取及常见问题分析 RNA提取及常见问题分析 DNA提取及常见问题分析 DNA提取的原则 DNA提取的方法 DNA提取常见问题分析 保证DNA一级结构的完整性 排除其它分子的污染 RNA、蛋白质、多糖等 基因组DNA的提取 CTAB法 SDS法 质粒DNA的提取 碱裂解法 煮沸法 线粒体、叶绿体DNA的提取 差速离心结合SDS裂解法 基因组DNA提取主要方法 CTAB法 适用于植物组织，真菌等 SDS法 适用于动物组织，血液，细胞，细菌，酵母等 CTAB法(植物DNA提取经典法) 基因组DNA－ CTAB法 基因组DNA－ CTAB法 CTAB法流程图 植物基因组DNA提取试剂盒 SDS法 原理 SDS 阴离子去垢剂 高温（55～65℃）裂解细胞，蛋白变性，染色体离析 高盐(KAc或NH4Ac) 或降低温度（冰浴） 使蛋白质及多糖杂质沉淀 上清液中的DNA用酚/氯仿抽提 乙醇沉淀水相中的DNA 细菌基因组DNA提取试剂盒 血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒 病毒基因组提取试剂盒 酵母基因组DNA提取试剂盒 CB2：20 (μg) 细菌基因组DNA提取试剂盒 1－5ml细菌菌液/离心柱 10-40 μg 血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒 全血 100 μl－1ml 3-30 μg 动物细胞培养液 106－107cells 5-30μg 动物组织 30mg 10-30μg 病毒基因组提取试剂盒 DNA RNA 酵母基因组DNA提取试剂盒 Lyticase(20U/ μg） 96血液基因组DNA试剂盒 一次实验可提取96个样品，快捷、方便。 基因组DNA－其它裂解方法 根据细胞裂解方式的不同有： 物理方式：玻璃珠、超声波、研磨、冻融 化学方式：异硫氰酸胍、碱裂解 生物方式：酶法 基因组DNA纯化的方法 吸附材料结合法： 硅基质膜(离心柱型)DNA产物纯化试剂盒 质粒DNA提取 TIANGEN BIOTECH(BEIJING) CO., LTD. 碱裂解法 煮沸法 　碱裂解法原理 碱裂解法流程图 96系列 细胞器DNA提取 TIANGEN BIOTECH(BEIJING) CO., LTD. 细胞器DNA 线粒体 叶绿体 基因组DNA 新鲜材料，低温保存 血液基因组DNA提取选择有核细胞 细胞培养时间不能过长 含病毒的液体材料提取前先富集 质粒DNA 对数期的菌体 培养时应加入筛选压力 低拷贝或大质粒，应加大菌体用量 菌株不要频繁转接（质粒丢失） 基因组DNA 材料过多影响裂解，导致DNA量少，纯度低 针对不同材料，选择适当的裂解预处理方式： 植物材料－－液氮研磨 动物组织－－匀浆或液氮研磨 组培细胞－－蛋白酶K 细 菌－－溶菌酶破壁 酵 母－－破壁酶或玻璃珠 质粒DNA 菌体量适当，除净培养基 变性的时间不要过长（5分钟） 控制复性时间，避免基因组DNA的污染 G＋菌、酵母细胞酶或机械处理 RNA提取及常见问题分析 TIANGEN BIOTECH(BEIJING) CO., LTD. RNA提取相关知识及注意事项 RNA提取方法 RNA提取常见问题分析 mRNA的应用 RT-PCR, Northern杂交，cDNA文库构建 mRNA末端快速扩增(RACE)，差异表达(DDRT-PCR)，引物延伸反应，体外转录RNA标记，RNA酶保护试验，RNA微注射(RNA Microinjection) RNA的不稳定性 RNAsafe RNA提取相关知识及注意事项 RNA提取方法 RNA提取常见问题分析 RNA提取流程示意图 可选择的RNA提取产品 植物组织选取杂质少生长较快的幼嫩部位 培养细胞除尽培养液 消化系统的组织选取杂质少的部位 细菌和酵母需要破壁处理 样品切成小块投入液氮或专门的RNA样品储存