基因工程第三章20093.ppt

第三章 基 因 工 程 载 体本章主要讲授内容： 质粒载体 λ噬菌体载体 单链DNA噬菌体载体 粘粒载体 载体定义 分子克隆载体是一类可供外源DNA插入并携带重组DNA分子进入适当宿主细胞的DNA分子。 载体特点 1. 至少有一个复制起点，因而至少可在一种生物体中自主复制。 2.?至少应有一个克隆位点，以供外源DNA插入。 3.?至少应有一个遗传标记基因，以指示载体或重组DNA分子是否进入宿主细胞 载体种类 质粒载体（plasmid) λ噬菌体的衍生物 柯斯质粒（cosmid) 单链DNA噬菌体M13 动物病毒 第一节 质粒载体 一、质粒载体的一般生物学特征 1.定义: 质粒是染色体外能够自主复制的双链闭合环状DNA分子。 广泛存在于细菌细胞中，在蓝藻、霉菌、酵母甚至真菌细胞中都发现有质粒分子的存在。 2.质粒DNA的一般生物学特性 （1）分子特性 a 构型 三种 （2）质粒的复制类型 根据质粒DNA复制与宿主之间的关系或质粒在宿主细胞中拷贝数的多少将质粒分为两种类型： 严紧型 1-3个拷贝 松弛型 10-200个拷贝 （3）质粒的不亲和性 所谓质粒的不亲和性（不相容性）是指在没有选择压力的情况下，两种不同质粒不能在同一个宿主细胞系中稳定地的共存的现象。 （4）质粒的转移性 质粒的转移性是指质粒从一个细胞转移到另一个细胞的特性。 结合型：可自我转移，大多为严紧型质粒 非结合型：不可自我转移，安全，为基因工程中常用。大多为松弛型质粒 二、理想质粒载体的必备条件 1.天然质粒用作载体的局限性 天然质粒是指没有经过体外修饰改造的质粒 具有分子量大，克隆能力低，拷贝数低，提取难度大，克隆位点有限，编码基因具免疫筛选等不足之处。 2.理想质粒载体的必备条件： （1） 分子量尽量小， （2）应最大限度的具有各种常用限制性内切酶的 单一酶切位点， （3）具两种以上的选择标记基因 ； （4）缺失mob基因 （5）重组质粒较易导入宿主细胞并复制和表达。 二、普通型载体pBR322 1.PBR322的一般生物学特性 a PBR322 大小为4.363kb 为松弛型质粒，复制起始点来源于pMB1 b 四环素抗性基因（Tet r)来源于pSC101 c 氨苄青霉素抗性基因（ Amp r）来源于pSF2124 d 12 种限制性内切酶的单一识别位点。分别位于Tet r 和Amp r中 2.PBR322的优点 a 分子量小 4363bp 统一规定记数从EcoRI识别位点GAATTC的第一个T为1 b 两种抗生素抗性基因，可作为重组体的选择标记，便于筛选重组体。 Tetr 基因内有7个酶切位点， Ampr 基因内有3 个酶切位点， Ori内有2个酶切位点 插入失活：因插入外源DNA 片段而使基因失活的现象 c 具有较高的拷贝数 1000-3000/细胞 为了克服EcoR I位点不具备插入失活效应这一缺点，引入具有EcoR I单一酶切位点的Cmlr基因，得到新质粒pBR325. 三、常用质粒载体类型 （一） 克隆质粒载体 克隆质粒载体是指专用于基因或DNA片段无性繁殖的质粒载体。目前常用的克隆质粒载体有pBR322、pUC及其派生质粒载体。 1.pBR322及其派生的质粒载体 pAT153 pBR325 2. pUC系列的质粒载体 一种典型的pUC系列的质粒载体包括如下4个组成部分: (1) pBR322的复制起始点 (2)氨苄青霉素抗性基因 　(３)ＬacZ’基因 (４)半乳糖苷酶的氨基端 pUC质粒载体的特点: 1.具有更小的分子量 pUC8/ pUC9 2750bp pUC/18 pUC19 2686bp 2.利用组织化学法筛选重组体 3.具有多克隆位点 4.具有更高的拷贝数 （二）表达质粒载体 表达质粒载体是指专用于在宿