分子生物学实验小技巧.pdf

分子生物学实验小技巧 主要内容 1.SDS.双向电泳 3.质粒提取 4.Western Blot 5.溶液配制 6.PCR、酶切、连接并进行凝胶检测 7.RNA提取与检测 8.其他 SDS 1.? ?? ? SDS配制过程中，浓缩胶与分离胶可预先配好大体积（如 100ml） 预制胶，储存在 4 度冰箱（注： 10% APS，TEMED不加），每次配置时只需吸取 所需体积的预制胶加入相应体积 APS，TEMED 即可，预制胶可储存半年以上， 能节省很多时间，更重要的是，可大大减少与丙稀酰胺的接触，减少中毒。 。 2.? ?? ?配胶过程中，普通的 SDS中加入约 13%的甘油，可以提高分辨率， 有效防止小分子量蛋白的弥散。改进过程只需将配方中的水改成 60%的甘油即 可。。 3.? ?? ?胶配好后，若过夜使用，待凝聚后不要拔下梳子，把含胶玻璃板从制胶 槽取下，注意玻璃板上下两边缘会有气体，所以需要加一点电泳缓冲液以避免 胶内水分蒸发，用保鲜膜包上，然后放 4 度过夜，第二天在电泳槽内直接拔下 梳子即可使用。 4.? ?? ? 分离胶用水压胶不平时，可以换用乙醇（浓度无要求，干净即可） ，效 果较好。 5.? ?? ? 配置分离胶时因胶凝时收缩常导致加样孔变浅，可以将加剩的胶放入 4 ℃ 以降低凝聚速度，而将凝胶放入 37 度促聚，并随时用 4 ℃加剩的胶补充下降的 胶面；另外将胶横放与水平面成 10 度角也可以减少收缩的影响。 6.? ?? ?丙烯酰胺放置时间过长（超过一年） ，会吸水潮解，导致胶不凝。 。 7.? ?? ?凝胶时温度高凝胶快， 但过高时，会影响交连物的孔径大小， 25℃为宜。 8.? ?? ?氧气是胶凝固的终止剂，所以尽量避免胶中气泡出现。 。 9.? ?? ?大肠表达检测时，一般要煮样，但煮出来时常较稠，用 8M 尿素重悬细 胞后再煮效果较好。 10.? ?配好的 10 ×TBE经过高压灭菌后，不会形成沉淀，可以用很长时间，而且 跑出的条带也很漂亮。 11.? ?上样时，最后保证上样量一样，包括体积，当体积不同时，可以加缓冲液 补全，这样跑出的胶较为一致。所有的加样孔都加样，可以防止边缘的样品拖 尾，如样品不多，其余的孔均用上样缓冲液加满，防止影响条带扩散。 12.? ?跑胶时，因为低电压跑会避免高电压产生的热量尔导致的胶层变形，所以 低电压泳道会比高电压泳道跑的直一些，且分离效果更高，有利于分子量相差 不大的蛋白分离。 。 13.? ?跑胶过程中， 为节省时间， 可以提高电压， 但得注意散热， 可以冰浴跑胶， 将电泳槽放入盛有冰水的盆中， 或是冰箱中，节省的时间的同时， 效果也较好。。 14.? ?防止条带跑歪：分离胶配好后 4 度过夜；在点样的时候紧靠于上样两边的 点样孔各上 20 微上样缓冲液。 15.? ?电泳完撬胶时根本不需要用撬胶板，用流水冲玻璃板的缝隙处（也就是凝 胶部分），一边冲一边轻轻掀起玻板，用水去充满玻板和胶之间的缝隙，很容易 能把玻板掀开。接下来把玻板反过来，让胶面朝下，使其一端浸入到一个盛着 水的大平皿中，轻轻晃动，胶很快就会被水带到平皿中了，丝毫不会损伤胶。 。 16.? ?染色时，为节省染色时间，可以先将染色液在微波炉内加热 5-10 秒，不能 太久，避免冰醋酸挥发，然后在水平摇床上放置半个小时即可染色好。如果是 旧染色液，隔十分钟加热一次。 。 17.? ?脱色时，可不用脱色液，直接用去离子水，放微波炉中高火里煮沸