大提质粒步骤完整版.pdf

大提质粒步骤 试剂配制： 1. 1M NaOH (400ml ) ：分子量为 40，秤取 16g NaOH，溶于 400ml DDW 中。 2. 2M Tris-HCl (500ml) ：分子量为 121.14，秤取 121.14g Tris，溶于 400 ml DDW 中，用 HCl 调节 pH 值为 8.0，定容至 500ml 。 3. Buffer P1 (1000ml)：用 50ml 离心管量取 20ml 0.5M 的 EDTA ，然后量取 25ml 2M 的 Tris-HCl ，加入 700ml DDW ，用 HCl 调节 pH 值为 8.0，定容至 1000ml。 4. Buffer P2 （1000ml）：称取 10g SDS，放入 1000ml 的玻璃瓶中，然后加入 750ml DDW ，最后加入 200 ml 1M 的 NaOH，混匀，室温放置过夜，使其自溶。 (注： 不需要定容，严格按步骤操作。 ) 5. Buffer P3 (1000ml) ：秤取 294.42g 乙酸钾，溶于 800ml DDW 中，用冰醋酸调 节 pH 值为 5.5，定容至 1000ml。 6. Buffer QBT （1000ml）：分别称取 NaCl 43.83g，MoPS 10.46g，加入 600ml DDW ， 用 NaOH 调节 pH 值为 7.0，然后加入 150ml 异丙醇，定容至 1000ml。 7. Buffer QC （1000ml）：分别称取 NaCl 58.44g，MoPS 10.46g，加入 600ml DDW ， 用 NaOH 调节 pH 值为 7.0，然后加入 150ml 异丙醇，定容至 1000ml。 8. Buffer QF （1000ml）：称取 NaCl 73.05g，量取 2M Tris-HCl 25ml ，加入 800ml DDW ，用 NaOH 调节 pH 值为 8.5，然后加入 150ml 异丙醇，定容至 1000ml。 9. 10×TE Buffer ：量取 1MTris-HCl(pH8.0) 100ml ，500mM EDTA(pH8.0) 20ml ， 加入 800mlDDW ，均匀混合后定容至 1L。 10. 配制 RNase： (1) 将 RNase粉末溶于 10mM 的乙酸钾 （即Buffer P3），配制成浓度为 10mg/ml 的溶液。 (2) 将配好的 RNase溶液 100℃加热 10min, 随后冷却至室温。 (3) 用 1M 的 Tris-HCl 调节 pH 值至 7.4，大约需要 0.1 体积的 Tris-HCl 。 (4) 分装 RNase溶液于 1.5ml EP 管中， -20℃保存。 使用前注意事项： 在提 low-copy （低拷贝）质粒时，增加 lysis buffer （裂解液）体积可以提高 碱性裂解的效率以及 DNA 的产量。 Buffer P1 在使用前加 RNase A solution （RNA 酶溶液），一瓶 Buffer P1 加入 一小瓶 RNase A （用前瞬时离心），终浓度为 100ug/ml。 检测 Buffer P2 是否有因低温储存而引起的 SDS 沉淀。如有必要，将 SDS 在 37℃溶解。 Buffer P3 在 4℃下预冷。 1、在选择平板上挑选一个单克隆， 在相应抗性的 LB2— 5ml 中进行初培养：37℃ 摇床 300rpm 下初培养约 8h 。 （使用的管子或烧瓶至少是培养体积的 4 倍。） 2、将初培养菌液用选择性 LB 培养基稀释到 1/500 到 1/1000。High-copy plasmid （高拷贝质粒）：用 100-200ul初培养液接种