细胞凋亡的流式检测应用.ppt

与细胞凋亡有关的疾病 细胞凋亡研究 1.鉴别凋亡与坏死: Annexin Ⅴ/PI(7-AAD) 2.测定凋亡率: Annexin V、TUNEL 3.研究凋亡触发机制： Caspase、Fas及FasL、bcl-2/bax Annexin V细胞膜磷脂酰丝氨酸检测： Annexin V/PI凋亡检测试剂盒及相关试剂 Annexin V/7-AAD凋亡检测试剂盒及相关试剂 此法简单、可靠，由于凋亡时细胞膜的改变大大早于DNA 的改变，因此Annexin V/PI(或7- AAD )双染色是检测早期凋亡细胞的敏感方法。 由于该法必须用活细胞，因此检测时间受到限制，且对凋亡晚期细胞和坏死细胞无法准确区分。 Fluo-3-Am为新型的高度特异性Ca2+荧光指示剂，进入细胞后经非特异性酯酶脱去Am酯，成为脂溶Fluo-3留在细胞内，当Fluo-3与胞内游离钙结合后，其荧光强度是Fluo-3本身的40倍以上，当用480nm波长激发时，其荧光强度与游离钙离子浓度成正比。 Fluo-4 将Fluo-3结构中的Cl替换成F ， 荧光强度比Fluo-3强1倍 Fluo-4与钙离子的亲和力和Fluo-3近似，使用上和Fluo-3也基本相同，可以使用流式细胞仪检测细胞内钙离子浓度的变化。 Fluo-4-AM是Fluo-4的乙酰甲酯衍生物，通过培养，能够轻易进入细胞中。AM进入细胞后会被胞内酯酶所水解，产生的Fluo-4随后会和钙离子结合并发出荧光。 2.3 细胞内钙离子测定 JC-1是一种广泛用于检测线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential) ΔΨm 的理想荧光探针。 线粒体膜电位较高时，JC-1聚集在线粒体的基质(matrix)中，形成聚合物(J-aggregates)，可以产生红色荧光……正常细胞 线粒体膜电位较低时，JC-1不能聚集在线粒体的基质中，此时JC-1为单体(monomer)，可以产生绿色荧光……凋亡细胞 线粒体膜电位的下降是细胞凋亡早期的一个标志性事件。通过JC-1从红色荧光到绿色荧光的转变可以很容易地检测到细胞膜电位的下降，同时也可以用JC-1从红色荧光到绿色荧光的转变作为细胞凋亡早期的一个检测指标。 2.4 线粒体膜电位检测 喜树碱(CPT)诱导HL-60细胞凋亡，3小时后用JC-1检测线粒体膜电位的改变。可见，凋亡细胞红色荧光降低。 检测方法： 收集细胞于JC-1溶液中 37度孵育15-20min 离心、去上清 重悬于孵育缓冲液中 流式分析 FL1:凋亡细胞； FL2:正常细胞 caspases家族在凋亡过程中起到非常重要的作用，其中caspases - 3 是最重要的指示蛋白酶。 研究结果表明， caspases - 3 可在凋亡发生的早期被激活，激活的caspases - 3 继而使其他caspases 裂 解并被激活，同时还可激活细胞质和细胞核中的相关成分。 caspases - 3 的活性只有在凋亡的早期才能检测到，随后在凋亡的过程中持续升高，在凋亡的晚期快速下降。 对caspases - 3 的连续监测，可动态观察凋亡的整个过程。 2.5 Caspases细胞酶的检测 该法简单、快速，但不适于常规多功能流式细胞仪(不具备紫外光源)的检测。 主要有Caspases-3流式细胞检测试剂盒，Caspases-2/ Caspases-4/Caspases-6/Caspases-7/Caspases-9等抗体 3.5 Caspases细胞酶的检测 2.6 DNA 碎片分析：Apo-BrdU 核酸内切酶活化使核小体内DNA断裂为50~300kb片段，裂解为200bp DNA碎片，暴露出多个3’羟基末端。利用外源性TdT使外源性dUTP或 BrdUTP 连接到DNA 碎片的3羟基末端。 以荧光标记抗dUTP或抗BrdUTP抗体检测dUTP或BrdUTP数量，从而间 接检测凋亡 加PI 染色，在定量检测凋亡细胞同时显示凋亡细胞在细胞周期中所位置 3.6 DNA 碎片分析：Apo-BrdU 在此法中，细胞固定先用甲醛，再用乙醇 因为在凋亡细胞中可以检测出两群DNA： 一群是低分子量的DNA (100~200bp) ，弥散分布在凋亡细胞 另一群是高分子量的DNA 或仍然黏附在核基质上的DNA ， 乙醇固定后冲洗不能将其从细胞中洗去。 主要产品有Apo-BrdU FITC 检测试剂盒  用树碱(CPT)诱导HL-60细胞凋亡，0、120和15