第十二讲印迹杂交技术.pdf

第十二章 印迹杂交技术 Molecular hybridization 印迹技术(blot) ——指将电泳分离的样品（核酸或蛋 白质）从凝胶转移到印迹膜上，然后 与标记探针进行杂交来检测样品的方 法。 • 印迹法分类： Southern Blot DNA印迹 Northern Blot RNA印迹 Western Blot 蛋白质印迹（免疫印迹） Eastern Blot Western Blot的一种变形 第一节 核酸杂交的 基本概念 温度、酸碱、有 机溶剂、尿素等  核酸变性：在某些理化因素作用下，核 酸分子互补双链之间氢键断裂，使双螺 旋结构松散变成单链的过程。  DNA变性：在变性因素作用下，DNA分 子互补双链之间氢键断裂，使双螺旋结 构解开成两条单链的过程。  DNA复性（renaturation）：在适当条 件下，变性DNA的两条互补链可恢复天 然的双螺旋构象。  退火（annealing）：热变性的DNA经缓 慢冷却后即可复性。 DNA 变性的本质是双链间氢键的断裂 变性引起紫外吸收值的改变 DNA 的紫外吸收光谱 • 增色效应：核酸在变性过程中260nm 波长吸收值（A260 ）增加 • 减色效应：核酸在复性过程中260nm 波长吸收值（A260 ）减小 DNA加热 50%DNA 发生变性 此时的温度——解链温度 （melting temperature, Tm） G—C百分含量与Tm的关系 核酸分子杂交 单链的核酸分子在合适条件下，与具有碱 基互补序列的异源核酸形成杂化双链的过 程。 • 核酸分子杂交可在DNA与DNA、DNA与RNA、RNA 与RNA的两条单链间进行。 核酸分子杂交的体系 液相杂交：待测核酸和探针均游离于溶液。 固相杂交（常用）：将待测核酸（或探针）固 定于固相支持物，然后与溶液中的游离探针（或 待测核酸）进行杂交，形成的杂交体结合于固相 支持物上。 第二节 核酸探针与 标记 探针(probe) ——能与待测的分子发生特异性相互作用， 并可被特殊的方法探知的分子（带有标记 物）。 • 探针的检测对象：核酸、蛋白质、细胞结构等。 • 除核酸探针外，探针利用抗体-抗原、配体-受 体等相互作用的原理与靶分子结合。 一、核酸探针 ——带有标记物且序列已知的核酸片段， 能与待测核酸中的特定序列特异杂交。 • 核酸探针是否合适是决定核酸杂交分析 能否成功的关键。 核酸杂交与分子探针 核酸探针应具有的条件 ① 特异性高：只与待测核酸样品中的 互补序列杂交。 ② 带有标记物：标记物灵敏度高而稳 定，检测方便。 核酸探针的种类  基因组DNA探针  cDNA探针  RNA探针  寡核苷酸探针 基因组DNA探针 • 直接从基因组文库中筛选后、酶切制备； 或用PCR扩增基因组中的目的基因制备。 • 包含目的基因的全部序列或部分序列， 是最常用的DNA探针。 • 优点：制备简便；不易降解；标记方法 成熟。 • 注意：尽可能用基因的编码顺序（外 显子）作为探针。 cDNA探针 优点：mRNA逆转录而来，不含内含子等 非编码区，特异性高；适用于研究基因表达。 缺点：获取过程复杂，不易制备 RNA探针 ① 是单链探针，所以