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第二章 光学显微技术 第二章 光学显微技术 光学显微镜的发展历程 光学显微镜的成象原理 光学显微镜的构造和光路图 显微镜的重要光学参数 样品制备 1. 光学显微镜的发展历程 1590年，荷兰的詹森父子(Hans and zachrias Janssen) 制造出第一台原始的、放大倍数约为20倍的显微镜。 16l0年，意大利物理学家伽利略(Galileo)制造了具有物镜、目镜及镜筒的复式显微镜。 1665年，英国物理学家罗伯特·胡克(Robert Hooke)用左图这台复式显微镜观察软木塞时发现了小的蜂房状结构，称为“细胞”，由此引起了细胞研究的热潮。 1684年，荷兰物理学家惠更斯(Huygens)设计并制造出双透镜目镜－惠更斯目镜，是现代多种目镜的原型。这时的光学显微镜已初具现代显微镜的基本结构(右图)。 1. 光学显微镜的发展历程 在显微镜的发展史中，贡献最为卓著的是德国的物理学家、数学家和光学大师恩斯特·阿贝(Ernst Abbe)。 他提出了显微镜的完善理论，阐明了成像原理、数值孔径等问题，在1870年发表了有关放大理论的重要文章。 两年后．又发明了油浸物镜，并在光学玻璃、显微镜的设计和改进等方向取得了光辉的业绩。 2. 光学显微镜的成象原理 2.1 衍射的形成 2.2 阿贝成像原理 2.1 衍射的形成 物理光学把光视为一种电磁波，具有波粒二象性，即波动性和粒子性。由于光具有波动性质，使得光波相互之间发生干涉作用，产生衍射现象。 狭缝实验 屏幕上的P1点到狭峰上边缘的距离和它到狭峰下边缘的距离之差为一个波长。 从狭峰上缘和从狭峰下缘发出的两列光波在P1点相互增强，但这两列光波不过是从连线b上发出的无数光波中的一对，其他任意两列光波到达P1点的波程差均小于一个波长。 整个狭峰内发出的光波的累计相干效果，是在P1点两侧造成一个光强的低谷，P1点位于谷底位置。 相反，在P2点处，从狭缝上缘和下缘发出的光波的波程差1? 个波长，P2成为相干增强区的中心，称为第一级衍射极大值。 衍射结果 点光源通过透镜产生的埃利斑第一暗环半径 式中 n为介质折射率，λ照明光波长，α透镜孔径半角，M透镜放大倍数 说明埃利斑半径与照明光源波长成正比，与透镜数值孔径成反比． 2.2 阿贝成像原理 对于周期性结构的物体，图像的形成用阿贝成像原理来解释。 光线通过细小的网孔时要发生衍射，衍射光线向各个方向传播，凡是光程差满足 k=0，1，2，…的，互相加强。同一方向的衍射光则成为平行光束。 平行光束通过物镜在后焦面上会聚；形成衍射花样。衍射花样上的某个衍射斑点是由不同物点的同级衍射光相干加强形成的；同一物点上的光由于衍射分解，对许多衍射斑点有贡献。 从同一物点发出的各级衍射光，在产生相应的衍射斑点后继续传播，在象平面上又相互干涉，形成物象 阿贝成像原理 阿贝成像原理可以简单地描述为两次干涉作用：平行光束受到有周期性特征物体的散射作用形成衍射谱，各级衍射波通过干涉重新在像平面上形成反映物的特征的像。 物与象之间的相似性 物象是由直射光和衍射光互相干涉形成的，不让衍射光通过就不能成象，参与成象的衍射斑点愈多，则物象与物体的相似性愈好。 3. 光学显微镜的构造和光路图 4． 显微镜的重要参数 4.1 数值孔径 4.2 分辨率 4.3 放大率和有效放大率 4.4 光学透镜的象差 4.1 数值孔径 数值孔径（NA）是物镜前透镜与被检物体之间介质的折射率（n）和半孔径角（α）的正弦之乘积。NA= nsinα 孔径角是物镜光轴上的物点与物镜前透镜的有效直径所形成的角度。孔径角越大，进入物镜的光通亮就越大，分辨率越高。孔径角与物镜的有效直径成正比，与焦点的距离成反比。 根据阿贝成像原理，衍射光线反映了物体形貌的细节，因此一个物镜要反映物体的细节，必须能够接受尽量多的高阶衍射光线。 物镜接收衍射光线的能力也强烈的依赖于在样品与镜头之间的介质。因此，数值孔径的概念更加能够有效的描述物镜的成像能力。 4.2 分辨率 分辨本领 此时, 样品上相应的两个物点间距离?r。定义为透镜能分辨的最小距离，也就是透镜的分辨本领。 ?r。═ R。? M 分辨本领是由物镜的NA值与照明光源的波长两个因素决定，NA值越大，照明光线波长越短，分辨率就越高。 4.3 放大率和有效放大率 由于经过物镜和目镜的两次放大，所以显微镜总的放大率Γ应该是物镜放大率β和目镜放大率Γ1的乘积： Γ=βΓ1 显微镜放大倍率的极限即有效放大倍率。 当选用的物镜数值孔径不够大，即分辨率不够高时，显微镜不能分清物体的微细结构，此时即使过度地增大放大倍率，得到的也只能是一个轮廓虽大但细节不清的图像，称为无效放大倍率。 4.4 光学透镜的象差 （1 ）球面象差（简称球差