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单克隆抗体制备技术的改进 李丽英 乐山职业技术学院610300四川乐山 摘要鉴于血管内皮细胞生长因子受体(KDR)的重要生物学作用，我们采用杂交瘤技术割备能稳定分泌抗KDR单 克隆抗体的杂交瘤细胞：本文就抗KDR单克隆抗体制备过程中所涉及的技术改进作一总结。 关键词单克隆抗体单克隆抗体制备技术KDR endothelial 在血管内皮细胞生长因子(vascular grow山factor，性，并具有一定的细胞毒性，在细胞融合过程中应严格控制反应 vEGF)家族中，vEGF—A在肿瘤血管新生中发挥着重要作用，时间，通常以1～2min为宜。PEG是一种高渗溶液，在加入PEG 它能促使内皮细胞有丝分裂，诱导血管内皮细胞增殖和迁移， 进行融合时以及加入稀释溶液终止融合时，都应缓慢加入。 促进新生血管形成，还能增加血管通透性…。vEGF—A的这些生 2 杂交瘤细胞的选择培养 物学效应主要是通过血管内皮细胞生长因子受体，又含激酶插 融合后的细胞需要在由次黄嘌呤H、氨基喋呤A、胸腺嘧啶 kinaseinsertdomain 入区的受体(Human containingreceptor， T按一定比例混合而成的选择培养基中培养。细胞DNA合成一般 KDR)来实现的。I(DR属于酪氨酸激酶受体家族第Ⅲ亚型，相 有两条途径…：①主要途径是由糖、氨基酸合成核苷酸，进而合 对分子质量为200×lo‘一230×州，由7个免疫球蛋白样胞外结 成DNA，叶酸是该合成途径的重要辅酶；②另一补充途径是在 构域、1个跨膜结构域和1个含受体酪氨酸激酶的胞内区组成”1。 次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷存在的情况下，经次黄嘌呤磷酸核糖转 它高表达于被激活的血管内皮细胞上．若能抑制其活性，阻断 化酶和胸腺嘧啶核苷激酶的催化作用下合成DNA。甲氨蝶呤是 vEGF—A／KDR信号通路，vEGF—A就不能发挥作用，从而达到 叶酸的拮抗剂，所以HAT选择培养基可以阻断瘤细胞利用正常 抗肿瘤新生血管的目的。 途径合成DNA；融合所用的小鼠骨髓瘤细胞sP。，一Ag。。是经毒性 1 动物免疫及杂交瘤细胞的融合 培养基选出的次黄嘌呤磷酸核糖转化酶细胞株，不能在HAT选 择培养基中存活；正常的脾细胞在培养基中只能存活s一7d。因 本实验在制备抗KDR单克隆抗体过程中，参照了1975年 此，只有具有亲代双方遗传性能的融合细胞才可以在HAT选择 Kohle一1等发明的单克隆抗体制备方法及传统的杂交瘤技术，并 培养基中长期存活和繁殖。融合后2d，镜下可见大片成团的死细 做了一定的改进。首先选用可溶性GsT—KDR融合蛋白作为免疫 原，由于可溶性抗原的免疫原性比颗粒性抗原的免疫原性弱， 胞，尚未出现克隆细胞。由于培养孔及细胞内可能残留有氨基蝶 为了加强其免疫原性，我们在传统动物免疫方案基础上做了一 呤，所以仍需向杂交瘤细胞提供补救合成途径合成DNA所需的 HT。我们采取半定量换液，即每孔吸出100斗lHAT选择培养 定改进。初次免疫时，等体积GsT—KDR可溶性融合蛋白和福氏 完全佐剂充分乳化后常规皮下免疫；2