昆虫杆状病毒表达系统.ppt

昆虫杆状病毒表达系统 原核细胞系统 大肠杆菌细胞 操作简便 周期短、收益大 表达产物稳定 相对分子质量有限 不能对表达产物进行一些翻译后加工 、修饰 体外基因 表达系统 真核细胞系统 哺乳动物细胞 酵母细胞 昆虫细胞（杆状病毒表达系统） 独特特性 前言 高表达 低成本 安全性高 大规模生产 前言 昆虫杆状病毒表达系统是目前国内外十分推崇的真核表达系统。利用杆状病毒结构基因中多角体蛋白的强启动子构建的表达载体，可使很多真核目的基因得到有效甚至高水平的表达。 具有高效表达、基因克隆容量大、重组病毒易于筛选、安全性高、且有完备的翻译后加工修饰系统等特点，现已成为基因工程四大表达系统之一。 利用该表达系统获得重组蛋白可用于药物开发、疫苗生产、生物杀虫剂等多个领域。据文献统计，已有1000 余种外源基因在昆虫杆状病毒表达系统中得到了成功地表达，其中约有95% 的外源重组蛋白能够被正确的转译后加工修饰，具有与天然蛋白相同的生物活性。 昆虫杆状病毒表达系统 2.杆状病毒载体表达系统的特点 3.昆虫杆状病毒表达系统的应用 1.昆虫杆状病毒表达系统的构成 4. 参考文献 1.昆虫杆状病毒表达系统的构成 1.1 杆状病毒载体 1.2 昆虫细胞宿主 表达体系 1.昆虫杆状病毒表达系统的构成 表达过程 将外源目的基因插入到启动子下游 与杆状病毒重组，获得重组病毒 将重组的病毒纯化 感染昆虫细胞或虫体 外源基因随着病毒的复制而获得表达 1.1 杆状病毒载体 1.1.1杆状病毒简介 杆状病毒是研究细胞分子生物学的重要工具，同时也是外源基因在昆虫细胞中表达的载体。杆状病毒只来源于无脊椎动物，已发现600多种杆状病毒，其中仅有不到20 种进行了分子生物学研究。 杆状病毒的基因组为单一闭合环状双链DNA 分子， 大小为80~ 160kb，其基因组可在昆虫细胞核复制和转录。DNA 复制后组装在杆状病毒的核衣内，后者具有较大的柔韧性，可容纳较大片段的外源DNA 插入，因此是表达大片段DNA 的理想载体。其中, 用作外源基因表达载体的杆状病毒，目前仅限于核型多角体病毒( nuclear poly hedrosis virus, NPV) 。 1.1 杆状病毒载体 现已知基因组全序列的杆状病毒仅有7 种: 苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒( AcMNPV ) 家蚕核多角体病毒( BmNPV ) 黄杉毒蛾多核衣壳核多角体病毒( OpMNPV ) 舞毒蛾多核衣壳核多角体病毒( LdMNPV ) 甜菜夜蛾多核衣壳核多角体病毒( SeMNPV) 棉铃虫核型多角体病毒( HaNPV) 斜纹夜蛾核型多角体病毒( SpltMNPV) 1.1 杆状病毒载体 AcMNPV 是昆虫杆状病毒表达系统中最常用的载体，基因表达分为4 个阶段: 立即早期基因表达、早期基因表达、晚期基因表达和极晚期基因表达。 早于DNA 复制 病毒DNA 合成 多角体蛋白是形成包含体的主要成分，感染后期在细胞中的积累可高达30% ~ 50%，是病毒复制非必需成分，但对病毒粒子却有保护作用，可使之保持稳定和感染能力。 P10 蛋白为另一类高效表达的极晚期蛋白，也是一类病毒复制非必需成分，可在细胞中形成纤维状物质，可能与细胞溶解有关。 理想的外源基因插入位点 1.1 杆状病毒载体 载体重组原理：原理是人为将杆状病毒多角体蛋白两翼序列的同源序列引入含外源基因的质粒载体中，通过同源重组方式来实现外源基因对病毒多角体蛋白基因的替换。 由于杆状病毒分子质量约为134kb，不能利用多克隆位点（酶切连接）进行基因重组，只能利用杆状病毒和带有外源基因的质粒载体进行共转染（转移载体的介导）。 多克隆位点：DNA载体序列上人工合成的一段序列，含有多个限制内切酶识别位点。能为外源DNA提供多种可插入的位置或插入方案。 共转染：物理上不相连的基因被整合到同一整合序列并在同一转染细胞内表达的现象。 1.1 杆状病毒载体 1.1.2杆状病毒载体的重组 将极晚期基因( 如多角体基因及其边界区) 克隆入细菌的质粒中 消除其编码区和不合适的酶切位点 保留其5c端对高效表达必需的调控区 在下游引入合适的酶切位点供外源基因的插入，即得到转移载体。 将要表达的外源基因插入其启动子下游 与野生型AcNPV DNA 共转染昆虫细胞 通过两侧同源边界区在体内发生同源重组，使多角体蛋白基因被外源基因取代。 1.1 杆状病毒载体 1.1.3杆状病毒载体的筛选 由于多角体基因被破坏，则不能形成多角体。这种表型在进行常规空斑测定时，可同野生型具有多角体的病毒空斑区别开来， 这就是最初的筛选重组病毒的方式。 由于重组效率较低( 0