单克隆抗体制备新技术.ppt

单克隆抗体制备平台建立 尹芝南 美国耶鲁大学医学院副教授 南开大学生命科学学院院长 基本概念 抗原决定镞（抗原表位） 细胞克隆 多克隆抗体 单克隆抗体 Antigenic determinant 是指抗原分子中决定抗原特异性的 特殊化学基团，又称表位(epitope). 细胞克隆： 由一个细胞增殖而成的细胞集团 Polyclonal antibody,PcAb：针对多种抗原决定簇的混合抗体 Monoclonal antibody,McAb:由单个B细胞克隆产生的针对单一抗原决定簇的同源抗体 杂交瘤技术的理论基础 淋巴细胞产生抗体的克隆选择学说，即一种克隆只产生一种抗体 细胞融合技术产生的杂交瘤细胞可以保持双方亲代细胞的特性 利用代谢缺陷补救机理筛选杂交瘤细胞，并克隆化，制备McAb 当两个细胞紧密接触时，细胞膜可能融合在一起。融合细胞含有两个不同的细胞核，称为异核体，产生具有原来两个细胞基因信息的单个核细胞，称为杂交细胞（hybrid cell）。 细胞DNA合成途经 1.替代途径：次黄嘌呤（H） HGPRT 2.主要途径： 氨 基 酸 鸟嘌呤核苷酸 谷 氨 酰 胺 （A-） 尿核苷单磷酸 胸腺嘧啶核苷酸 TK 3.次要途径：胸腺嘧啶核苷（T） HAT选择培养基的原理 HAT选择培养基组分 次黄嘌呤（hypoxanthine,H) 氨甲喋呤（aminopterin,A):叶酸拮抗剂 胸腺嘧啶核苷（thymidine,T) 脾 抗原免疫的脾细胞(B细胞) 小鼠骨髓瘤细胞(B细胞恶性肿瘤) 1.抗体分秘(IgG+) 1.具永生性 2.HGPRT+在HAT生长 2. 8AG筛选出HGPTP-株 PEG 融合 HAT筛选  脾-骨髓瘤细胞（杂交瘤细胞） （HGPRT+、Ig+） 融合的结果及命运 免疫动物 培养骨髓瘤细胞 收集致敏的B淋巴细胞 收集骨髓瘤细胞 细胞融合 HAT选择培养基筛选杂交瘤细胞 检测筛选阳性细胞 克隆化培养（反复3-5次） 获得稳定分泌McAb的杂交瘤细胞株 McAb的制备（杂交瘤培养上清或诱生腹水） McAb 纯化及鉴定 制备单克隆抗体的基本技术 1 抗原提纯与动物免疫 2 骨髓瘤细胞及饲养细胞的制备 3 细胞融合 4 抗体检测 5 杂交瘤的克隆化和冻存 6 McAB的制备 7 单克隆抗体的纯化 免疫成功的标志是在融合时脾脏能够提供处于增殖状态的特异性B细胞，此时血清中抗体效价