brdu染色原理和步骤精编版.ppt

BrdU染色原理和步骤 YTH---xianyuanruxia EdU染色方法简介 BrdU染色原理 BrdU（5-溴脱氧尿嘧啶核苷）是胸腺嘧啶的衍生物，常用于标记活细胞中新合成的DNA，可代替胸腺嘧啶选择性整合到复制细胞中新合成的DNA中（细胞周期S期）。这种掺入可以稳定存在，随着DNA复制进入子细胞中。 BrdU 特异性抗体可以用于检测BrdU的掺入，从而判断细胞的增殖能力。 BrdU 特异性抗体可以用于检测BrdU的掺入，从而判断细胞的增殖能力。 活体注射或细胞培养后利用抗Brdu单克隆抗体，ICC染色，显示增殖细胞。同时结合其它细胞标记物，双重染色，可判断增殖细胞的种类，增殖速度，对研究细胞动力学有重要意义。因组织细胞内无内源性Brdu存在，所以Brdu应用较广 掺入双链DNA内的Brdu，以氢链与腺嘌呤结合，不能直接与抗Brdu抗体反应，需经解链使Brdu暴露方能被染色。常用的解链方法为盐酸加热、蛋白酶处理等，使DNA双链部分单链化，抗Brdu小鼠单克隆抗体与增殖细胞核内的Brdu结合，再经酶标抗小鼠IgG抗体孵育、呈色，显示进入S期细胞的情况。 改进和发展 由于盐酸和蛋白酶处理等可引起抗原或组织形态发生变化。为此，Conchoroff(1985)等制备了一种单克隆抗体（Bu—1），其培养液上清能与双链DNA的Brdu反应，因为培养液上清中含有DNA酶，可分解双链DNA，显露Brdu，达到染色目的。采用戊二醛固定后，胃蛋白酶—盐酸处理，亦得到了良好的染色结果。用双重或多重染色、观察何种细胞分裂增殖时，首先应染色其它抗原物质，最后显示Brdu。 通常在第一种抗体呈色后，再经1%戊二醛固定5～10min，重复染色程序，均可获得较满意的染色结果，分裂细胞核呈棕褐色；显示其它抗原用ALP标记抗体，则细胞浆为红色（FR）或蓝色（FB） 操作步骤 （1） （1）细胞以1.5×105 /ml细胞数接种于直径35 mm培养皿中（内放置一盖玻片），培养1 d，用含0.4％FBS培养液同步化3 d，使绝大多数细胞处于G0期。 （2）加入BrdU（储液：1.0 mg/ml,终浓度为0.03 μg/ml），37℃，孵育40min。 （3）弃培养液，玻片用PBS洗涤3次。 （4）甲醇/醋酸固定10 min。 （5）经固定的玻片空气干燥，0.3％H2O2 -甲醇 30 min灭活内源性氧化酶。 （6）5％正常兔血清封闭。 （7）甲酰胺100℃，5 min变性核酸。 （8）冰浴冷却后PBS洗涤，加1抗即抗小鼠BrdU单抗（工作浓度1：50），阴性对照加PBS或血清。 （9）按ABC法进行检测，苏木素或伊红衬染，在显微镜下随机计数10个高倍视野中细胞总数及BrdU阳性细胞数，计算标记指数（LI）。 BrdU staining protocol Materials and reagents Hydrogen chloride (HCl), 1 M and 2 M Borate buffer 0.1 M Borax (sodium tetraborate) 38.1 g/liter, pH to 9.0 Phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.4, with 0.1% Triton X-100 Method 1. Sections of paraffin-embedded tissues should be de-waxed before proceeding. 2. Incubate in HCl (1 M) for 10 min on ice to break open the DNA structure of the labeled cells. 3. This is followed by HCl (2 M) for 10 min at room temperature, then 20 min at 37°C. 4. Immediately after the acid incubations, neutralize by incubating the samples in borate buffer (0.1 M) for 10 min at room temperature. 5. Wash in PBS (pH 7.4), 0.1% Triton X-100 3 times, 5 min per wash. 6. Continue with standard staining procedure as described in the immunohistochemistry and cytochemistry protocols. 注意事项 1.BrdU配制方法：