cdna末端快速扩增技术race精编版.ppt

* * * * * cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends, RACE) 张晓玲 技术背景 基本RACE 原理和方法 样品要求 RACE 产物的鉴定和全长 cDNA 的获得 基本RACE原理 技 术 背 景 得到某基因的片段、全长或近全长cDNA的方法： 建立和筛选cDNA 和DNA 文库。 利用GenBank 数据库中的表达序列标签(express sequence tags , ESTs) 拼接出全长或近全长cDNA 。 是多聚酶链式反应即PCR。 cDNA 末端快速扩增(RACE) 技术。 用RNase 保护、S1 核酸酶谱和引物延 伸等方法来保证mRMA 5′末端的获取，但又需要大量的mRNA。 基本RACE 原理和方法 利用Oligo (dT) 对mRNA 进行反转录的同时在两头加上通用接头(引物) ， 从而可利用基因特异的引物 (gene specific primer，GSP) 通过PCR 反应快速获得 目的序列的5′端和 3′端。 RACE流程 5′-RACE法原理图 （1） （2） （3） （4） RNase H 样品要求： ◇ 提取Total RNA的材料要新鲜，采样后立即放入液氮中速冻或加入样品稳定剂。 ◇ Total RNA无降解，OD260/280=1.8 ~ 2.0。 ◇ 提供尽量多的实验材料：3′ RACE Total RNA＞15 μg；5′RACE Total RNA＞25 μg。如果基因的含量较低或者未知序列较长，样品量需相应增加。 RACE 产物的鉴定和全长 cDNA 的获得 3′或5′双链cDNA 限制性内切酶酶切 Southern blot 分析 克隆 3′和5′重叠序列的连接 RACE 产物的3′和5′ 末端序列的分析 合成相应引物 PCR获得全长cDNA SMART RACE cDNA synthesis Kit SMART RACE cDNA synthesis Kit 碱基互补 配对原则 AT之间 形成两个氢键 GC之间 形成三个氢键 poly(C)替代poly(A) 增加5′ 接头与cDNA 第一链的结合牢固性 增加模板中有效双链丰度 提高目的基因获取几率 SMART RACE cDNA synthesis Kit原理 cDNA第一链的合成机制 SMARTer RACE流程 5’ RACE流程图 3’ RACE流程图 GSP 与 cDNA 模板的关系 GSP 要求： 23–28 nt 50–70% GC Tm ≥ 65℃；降落式（touchdown）PCR，Tm 70℃ 与通用引物的 3’-末端不互补 GSP 与 cDNA 模板的关系 GSP1：5’-RACE PCR的反义引物 GSP2：3’-RACE PCR的正义引物 合适的酶切位点 100~200bp 注意：GSP1与GSP2的Tm值要相似 GSP 与 cDNA 模板的关系 NGSP：槽式（Nested）PCR引物 扩增后的预期： 具体实验方法 cDNA第一链的合成 阳性对照RACE PCR实验 cDNA末端的快速扩增 RACE产物鉴定 试剂盒试剂 比较用GSPs和NGSPs引物获得的PCR产物 Southern blot analysis Nucleo Trap Gel Exraction 克隆和测序RACE产物 * RACE 是一种应用特异引物和公用引物从低丰度转录本中快速扩增已知cDNA 片段旁侧5′和3′末端的简单而有效的方法,具有快捷、方便、高效等优点,可同时获得多个转录本。 * RACE 技术是由PCR 技术发展而来,获得cDNA5′和3′末端的方法,也被称为锚定PCR 或单边PCR 。 * 以Oligo ( dT) 17 和一个35bp 的接头的接合体 [ (dT) 17 - adaptor ]为引物反转录总RNA 得到( - )cDNA。引物的接头具有1～3 个在基因组DNA 中罕见的限制性内切酶位点,这样就在cDNA 的未知端接上了一段特殊的单一接头序列。然后用一个基因特异扩增引物(3′- amp) 与少量( - ) cDNA 退火(一般 1ng) 并延伸,产生互补的( + ) cDNA ,再用3′amp和接头引物进行PCR 循环即可扩增得到cDNA 双链。 与获得3′末端的原理一样,利用基因特异性引物(5RT) 反转录总RNA ,这个引物能保证反转录的特异性。然后将反转录产物从多余的引物中分离,用脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT) 加上poly (A)尾。( + ) cDNA 以(dT) 17 - adaptor 为引物进行合成,然后用接头引物和位于