7dna文库的构建和目的基因的筛选精编版.ppt

Gene?manipulation Isoschizomer , Isocaudiners , Site?preferences Plasmid?incompatibility , α-complementation , Shuttle?vector ，Vehicle ，Cosmid Colony?hybridization ，Dot?hybridization ，Primer?extension Plateau?effect ，Amplified?fragment?length?polymorphism ，Random?amplified?polymorphic?DNA ， Inverse?PCR Universal?primer ，Random?primer ，Primer?walking Genomic?DNA?library ，cDNA?library ，Subtractive?hybridization ，Two-hybrid?system Transformation ，Competent?cell 列混合池 行混合池 免疫筛选 免疫筛选法和核酸杂交的方法类似，只是其使用的探针不是核酸，而是特异性的抗体。 适合免疫杂交法筛选的外源基因首先要在宿主细胞中存在抗原蛋白的表达，用于筛选的 DNA 文库必须是表达文库，通常是原核生物的基因组 DNA 文库和真核生物的 cDNA 表达文库。而且，所检测的对象为宿主中不编码的基因或宿主中缺失表达的基因。 根据检测方法的不同，可以分为原位检测和免疫沉淀检测 滤膜（固定抗原） + 免疫沉淀检测法 菌落 沉淀素 酵母双杂交系统筛选 酵母双杂交系统由Fields和Song等首先在研究真核基因转录调控中建立。 典型的真核生物转录因子，如GAL4、GCN4等都含有二个不同的结构域：DNA结合结构域(DNA-binding domain)和转录激活结构域(transcription-activating domain)。 前者可识别DNA上的特异序列，并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游，转录激活结构域可同转录复合体的其他成分作用，启动它所调节的基因的转录。 这两个结合域将它们分开时仍分别具有功能，但不能激活转录，只有当被分开的两者通过适当的途径在空间上较为接近时，才能重新呈现完整的转录因子活性，并可激活上游激活序列（upstream activating sequence, UAS）的下游启动子，使启动子下游基因得到转录。 单独的DB能和启动子结合，但是不能激活转录。而不同转录激活因子的DB和AD形成的杂合蛋白仍然具有正常的激活转录的功能。如酵母细胞的Gal4蛋白的DB与大肠杆菌的一个酸性激活结构域B42融合得到的杂合蛋白仍然可结合到Gal4结合位点并激活转录。 双杂交系统的另一个重要的元件是报道株。报道株指经改造的、含报道基因(reporter gene)的重组质粒的宿主细胞。最常用的是酵母细胞。 酵母细胞作为报道株的酵母双杂交系统具有许多优点: 〈1〉 易于转化、便于回收扩增质粒。〈2〉具有可直接进行选择的标记基因和特征性报道基因。〈3〉酵母的内源性蛋白不易同来源于哺乳动物的蛋白结合。 原理： 在以上研究的基础上，将编码DNA-BD的基因与已知蛋白质Bait protein的基因构建在同一个表达载体上，在酵母中表达两者的融合蛋白BD-Bait protein。 将编码AD的基因和cDNA文库的基因构建在AD-LIBRARY表达载体上。 同时将上述两种载体转化改造后的酵母，这种改造后的酵母细胞的基因组中既不能产生GAL4，又不能合成LEU、TRP、HIS、ADE，因此，酵母在缺乏这些营养的培养基上无法正常生长。当上述两种载体所表达的融合蛋白能够相互作用时，功能重建的反式作用因子能够激活酵母基因组中的报告基因HIS、ADE、LACZ等，从而通过功能互补和显色反应筛选到阳性菌落。 酵母双杂交系统的优点 ⑴ 作用信号是在融合基因表达后， 在细胞内重建转录因子的作用而给出的， 省去了纯化蛋白质的繁琐步骤。 ⑵检测在活细胞内进行， 可以在一定程度上代表细胞内的真实情况。 ⑶ 检测的结果可以是基因表达产物的积累效应， 因而可检测存在于蛋白质之间的微弱的或暂时的相互作用。 ⑷ 酵母双杂交系统可采用不同组织、器官、细胞类型和分化时期材料构建cDNA文库， 能分析细胞质、细胞核及膜结合蛋白等多种不同亚细胞部位及功能的蛋白。 酵母双杂交系统局限性和存在的问题 ⑴ 双杂交系统分析蛋白间的相互作用定位于细胞核内， 而许多蛋白间的相互作用依赖于翻译后加工如糖基化、二硫键形成等， 这些反应在核内无法进行。 另外有些蛋白的正确折叠和功能有赖于其他非酵母蛋白的辅助，这限制了某些细胞外蛋白和