动物细胞培养及海水鱼类细胞系的建立.ppt

* 微生物污染的检测 细菌和真菌的污染和检测 肉眼直接观察法 培养检查法 显微镜观察法 * * 　　　　　第二部分 石斑鱼不同组织的原代和传代细胞培养 * 建立了对神经坏死症病毒和虹彩病毒敏感的石斑鱼脾细胞系（GS）(Qin, et al., 2006, Journal of Virological Methods) Fig. 2. GS细胞系的染色体核型分布。GS细胞系由48条染色体组成 Fig. 1. 正常培养的单层GS细胞 (100代） 感染虹彩病毒（A，B）和神经坏死症病毒（C，D）的GS 培养细胞。 透射电镜观察受虹彩病毒（A）和神经坏死症病毒（B) 感染的GS细胞。 免疫荧光抗体染色。（A）非感染对照细胞，（B）感染虹彩病毒的GS细胞 GS细胞转染绿色荧光蛋白基因（GFP）。 * 2.1 石斑鱼不同组织原代细胞和传代细胞的培养 * * * 2.2石斑鱼不同组织细胞的病毒敏感性试验－形态学观察 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 * * * 2.2石斑鱼不同组织细胞的病毒敏感性试验 －SGIV单克隆抗体免疫荧光检测　　　　　　　　　 * 2.3石斑鱼不同组织细胞的转染实验 * 2.４石斑鱼不同组织细胞的生长特性－培养基 Brain * 2.４石斑鱼不同组织细胞的生长特性－血清浓度 Kidney Spermary * 谢 谢！ * * 动物细胞培养及海水鱼类细胞系的建立 秦启伟，黄晓红 有害生物控制与资源利用国家重点实验室 中山大学生命科学学院 * 第一部分 （动物）细胞培养基本流程以及注意事项 * 细胞培养 细胞培养(cell culture) 的含义，简单地说即是把来自机体的组织经分散成为单个细胞，放在类似于体内的体外环境中生存，使其不断生长、繁殖或传代，借以观察细胞的生长、繁殖、衰老等生命现象。细胞培养技术在遗传学、免疫学、肿瘤学、病毒学、分子生物学等领域已得到广泛的应用。 　 * 单个细胞 原代细胞 细胞株 细胞系 剪碎，胰蛋白酶 分离细胞 原代培养 传代培养 （遗传物质没有发生改变） （遗传物质发生改变） 动物组织 动物细胞培养基本流程 * 细胞培养的材料准备 1 细胞培养液 2 胰酶消化液 3 PBS缓冲洗涤液 4 洁净无菌的细胞培养瓶、培养板 * 细胞培养基应用选择精要 选择培养基没有一定的标准，可供参考的几点建议： (1）建立某种细胞株所用的培养基应该是培养这种细胞首选的培养基。可以查阅参考文献，或在购买细胞株时咨询。 (2) 其它实验室惯用的培养基不妨一试，许多培养基可以适合多种细胞。 (3) 根据细胞株的特点、实验的需要来选择培养基。如小鼠细胞株多选 RPMI1640 。 (4) 用多种培养基培养目的细胞，观察其生长状态，可以用生长曲线、集落形成率等指标判断，根据实验结果选择最佳培养基，这是最客观的方法，但比较繁琐。 * 培养前准备 在开始实验前要制定好实验计划和操作程序。有关数据的计算要事先做好。根据实验要求，准备各种所需器材和物品放置操作场所(培养室、超净台)内消毒。这可以避免开始实验后，因物品不全往返拿取而增加污染机会。 培养室的消毒 无菌培养室每天都要用0.2%的新洁尔灭拖洗地面—次(拖布要专用)，紫外线照射消毒30-50min，超净工作台台面每次实验前要用75％酒精擦洗。然后紫外线消毒30min。—些操作用具如移液器、废液缸、污物盒、试管架等用75%酒精擦洗后置于台内同时紫外线消毒。 洗手和着装 原则上和外科手术相同。并于开始操作前要用75％酒精消毒手和前臂。如果实验过程中手触及可能污染的物品和出入培养室都要重新用消毒液洗手。进入原代培养室需彻底洗手还要戴口罩、着消毒衣帽。 培养过程中的无菌操作 在无菌环境进行培养或做其它无菌工作时，首先要点燃酒精灯。以后一切操作，如按装吸管帽、打开或封闭瓶口等，都需在火焰近处并经过烧灼进行。 进行培养时，动作要准确敏捷，但又不必太快，以防空气流动，增加污染机会。不能用手触及已消毒器皿，如已接触，要用火焰烧灼消毒或取备品更换。 * 原代培养 用直接从机体获得的细胞进行的培养称为原代培养 (Primary cell culture)。这种培养过程主要是采用无菌操作的方法，把组织（或器官）从动物体内取出，经酶或其它方式消化处理，使分散成单个细胞，然后在人工条件下培养，使其不断地生长和繁殖。原代培养是建立各种细胞系的第一步。 * 动物细胞原代培养过