细胞培养技术 (2).ppt

人PBMC（PHA活化剂刺激16h后）：细胞种类：人PBMC 养的天数：36h放大倍数：倒置显微镜 X10 培养基种类：RPMI1640+10%胎牛血清；细胞状态与特征简述:淋巴细胞母细胞化并聚集. 幼兔骨髓基质干细胞（原代）：细胞种类：幼兔骨髓基质干细胞 培养的天数：五天后放大倍数：倒置显微镜 X40培养基种类：DMEM+20%胎牛血清细胞状态与特征简述:细胞呈梭形，有伪足，边缘清晰整齐，贴壁生长 兔气管纤毛上皮细胞（原代培养）：细胞种类：纤毛上皮细胞 培养的天数：7天；放大倍数：倒置显微镜 X200； 培养基种类：DMEM+10%小牛血清； 细胞状态与特征:纤毛细胞呈圆形或椭圆形，有清晰纤毛覆盖， 摆动良好。 人PBMC（经EB病毒转化后的淋巴母细胞）：细胞种类：人PBMC；培养的天数：2 weeks；放大倍数：倒置显微镜 X10培养基种类：RPMI1640+15%胎牛血清（Hyclone公司)；细胞状态与特征简述:淋巴细胞母细胞化并聚集. 三、 应用 生物体是一个高度统一的整体，而细胞生物学的主要对象是生物体内的各种细胞，很显然，在整体条件下研究单个细胞或某一细胞群在体内（in vivo）的功能活动是非常困难的。细胞培养的意义主要在于两点，其一是人工培养条件易于改变并能严格控制，便于研究各种因素对细胞的结构、功能和各种生命活动规律的影响；其二是细胞在体外培养环境中可以长期存活和传代，可以比较经济地、大量地提供在同一时期、条件相同、性状相似的细胞作为实验样本。因此，大量生物医学研究工作依赖于细胞培养，许多重要的发现都基于培养细胞的工作。 细胞培养技术也存在着一定局限性，主要是细胞离体以后失去与体内环境的密切联系，失去了神经体液的调节和不同细胞间的相互作用，特定分化基因的表达减弱或停止，而进化中保守的细胞生长和增殖活动却可维持，遂使体内外细胞出现了差异，这是应用细胞培养技术应该注意的问题。 细胞培养技术除经典地用于细胞形态结构、功能和细胞活动研究以外，还成为近年发展起来的细胞工程技术的基础，也就是说细胞培养技术重要应用就是各种细胞工程技术。因此在此对这些相关技术作一简介。 一般地，细胞工程指应用各种手段对细胞不同结构层次(整体、细胞器、核、基因等)进行改造，如进行细胞融合、核移植、基因转移等，以获得具有特定生物学特性的细胞。 （一）细胞融合 在细胞自然生长情况下，或在其他人为添加因素存在下，使同种细胞之间或不同种类细胞之间相互融合的过程，即为细胞融合（cell fusion）。通过细胞融合，可将来源于不同细胞核的染色体结合到同一个核内，结果形成一个合核体的杂种细胞。在实际工作中常采用各种促融合手段，包括病毒类融合剂如仙台病毒、化学融合剂如聚乙二醇（PEG）及电激融合法等。 在进行细胞融合反应和适当时间的培养后，需要通过一定方法对两种亲本细胞融合产生的具有增殖能力的杂种细胞进行筛选。筛选方法主要包括药物抗性筛选、营养缺陷筛选和温度敏感性筛选等。 细胞融合最典型的应用是单克隆抗体技术。1975年Koehler和Milstein将用绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞和体外培养能长期繁殖的小鼠骨髓瘤细胞融合，获得了具有两种亲本细胞特性的杂交细胞，即既能在培养条件下长期生长增殖，又能分泌特异的抗绵羊红细胞的抗体的B淋巴细胞杂交瘤。细胞融合技术的发展和骨髓瘤细胞株的建成促成了B细胞杂交瘤技术的建立和单克隆抗体技术的成功。 （二）核移植 细胞核移植（nuclear transfer）是指将一个双倍体的细胞核（可来自胚胎细胞或体细胞）移植到去核的成熟卵母细胞或受精卵中。重组的卵细胞可以植入母体，并能发育为与供核细胞基因型相同的后代，因此又称为动物克隆技术。1997年诞生的克隆羊“多利”就是体细胞核移植技术的产物。 核移植技术首先是选取合适的受体去核卵细胞和供体核。目前均以发育至减数分裂中期II的成熟卵母细胞为受体，供体核则可以采用胚胎细胞、未分化的原始生殖细胞、胎儿细胞乃至高度分化的成年动物细胞。核质融合一般是将获得的核转移到已经人工去核的成熟卵母细胞卵周隙后，施加微电流脉冲，使核质融合，形成一个重组卵。重组卵需经一定时间的体外培养，或放入中间受体动物输卵管内孵育，经过一段时间的培养，有的动物需形成桑椹胚或囊胚，再植入受体子宫里。 （三） 基因转移（gene transfer） 基因转移指向受体细胞中导入外源基因，是改造细胞遗传性状的常用手段。一般情况下，能稳定接纳外源基因的细胞也只有受体细胞总数的千分之几。因此为了快速有效地筛选转化细胞，一般在转入基因中携带有特定的选择标记，目前应用较多的为细胞抗药性筛选，如根据新霉素抗性基因进行筛选。 基因