第八章蛋白质和氨基酸的测定（p114）第一节概述.ppt

第八章 蛋白质和氨基酸的测定 (p114)第一节 概述 蛋白质是含氮的有机化合物，分子量很大。主要由C、H、O、N、S五种元素组成。某些蛋白质中还含有微量的 P、Cu、Fe、I 等。 蛋白质是生命的物质基础，人体11%~13%总热量来自蛋白质。无论动物、植物都含有蛋白质，只是含量及类型不同。动物蛋白和豆类蛋白是优良的蛋白质资源。 蛋白质是食品的最重要质量指标，其含量与分解产物直接影响食品的色、香、味。 一般蛋白质含氮量为16%，即1份氮相当于6.25份蛋白质，此数值（6.25）称为蛋白质换算系数。 氨基酸是构成蛋白质的最基本物质，构成蛋白质的氨基酸主要是其中20种，二在构成蛋白质的氨基酸中，亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、色氨酸和缬氨酸等8种氨基酸在人体中不能合成，必须依靠食品供给，故被称为必须氨基酸。 蛋白质的测定方法可分为两大类： 一类是利用蛋白质的共性，即含氮量、肽键和折射率等测定蛋白质含量； 另一类是利用蛋白质中的氨基酸残基、酸性和碱性基因以及芳香基团等测定蛋白质含量。 食品和其原料中蛋白质含量的测定，最常用的方法是凯氏定氮法：它是测定总有机氮的最准确和操作较简便的方法之一。该法是通过测出样品中的总含氮量，然后乘一个蛋白质换算系数。这里也包括非蛋白的氮，所以只能称为粗蛋白的含量（但马铃薯等非蛋白氮多的要单测）。目前，测定蛋白质和氨基酸含量的方法很多，如： 双缩脲反应、染料结合反应、酚试剂法等。国外：红外分析仪。氨基酸总量：酸碱滴定法测定。各种氨基酸的分离与定量——色谱技术。有多种氨基酸分析仪。 第二节 蛋白质的定性测定 一、蛋白质的一般显色反应 （一）氨基黑法： 氨基黑10B是酸性染料，其磺基与蛋白质反应构成复合盐，是最常用的蛋白质染料。 ① 经点样后的层析纸经电泳或层析后，浸入氨基黑10B乙酸甲醇溶液中染色10min，染色后，用10％乙酸甲醇溶液洗涤5-7次，待背景变成浅蓝色后干燥。若欲进行洗脱，用0.1mol/L氢氧化钠浸泡30min，于595nm波长下比色测定。 氨基黑10B乙酸甲醇溶液：13g氨基黑10B溶解于100ml冰乙酸和900ml甲醇中，充分摇匀，放置过夜，过滤后可反复使用几次。 ② 聚丙烯酰胺凝胶电泳后染色： ③ 凝胶薄层的直接染色： 本法优点是灵敏度较高，缺点是花费时间长，不同蛋白质染色强度不同。 （二）溴酚蓝法： 经电泳或层析后滤纸或凝胶于0.1％溴酚蓝固定染色液（1g溴酚蓝，100g氯化汞溶于50％乙醇水溶液中，用50％乙醇稀释至1000ml）中浸泡15－20min，在30％乙醇：5％乙酸水溶液中漂洗过夜。如欲洗脱，可用0.1mol/L氢氧化钠。 此法缺点是灵敏度低，某些低分子质量的蛋白质可能染不上色。 （三）考马斯亮蓝法： 该染料和蛋白质是通过范得华力结合的。考马斯亮蓝含有较多的疏水基团，和蛋白质的疏水区有较大的亲和力，而和凝胶基质的亲和力不如氨基黑，所以用考马斯亮蓝染色时漂洗较容易。 ① 经电泳后滤纸或乙酸纤维膜在200g/L磺基水杨酸溶液中浸1min，取出后放入2.5g/L考马斯亮蓝R250染色液中浸5min，在蒸馏水或7％乙酸中洗四次，每次5min，于90℃放置15min。 ② 聚丙烯酰胺凝胶处理：凝胶用10％三氯乙酸固定，在10％三氯乙酸－1％考马斯亮蓝R250（19＋1）中室温染色0.5h，用10％三氯乙酸脱底色。 考 马斯亮蓝灵敏度比氨基黑高5倍，尤其适用于SDS电泳的微量蛋白质的染色。在549nm处有最大吸收峰，蛋白质在1-10μg呈线性关系。 （四）酸性品红法： 经电泳后滤纸置于0.2％酸性品红溶液中（2g酸性品红溶解于500ml甲醇，400ml蒸馏水和100ml冰乙酸中）加热染色15min；取出后浸入乙酸甲醇溶液（500ml甲醇，400ml蒸馏水和100ml冰乙酸）15min；然后浸入10％乙酸溶液，每次20min，至背景无色为止。如欲进行比色，可用0.1mol/L氢氧化钠浸泡2h，在波长570nm处比色。 （五）氨基萘酚磺酸法： 聚丙烯酰胺凝胶电泳后，把凝胶暴露在空气中几分钟，或在2mol/LHCl中浸一下使表层蛋白变性，再在0.003％氨基萘酚磺酸的0.1mol/L磷酸