技术人员培训课件PCR基因扩增-精选课件(公开).pptVIP

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2019-12-08 发布于广西
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技术人员培训课件PCR基因扩增-精选课件(公开).ppt

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乙肝病毒（HBV）PCR检测试剂盒组成 DNA提取液：裂解病毒蛋白外壳，使病毒DNA游离 PCR反应管：含有扩增HBV特异DNA片段的引物、 dNTPs、Taq酶、PCR缓冲液、Mg2＋等，只需加入模板即可进行扩增反应。阳性模板：纯化的HBV －DNA，无病毒外壳，无感染性，直接加入PCR反应管扩增后用作阳性对照。标本处理：每六人一组，取血清40ul加入0.5离心管，再加入 40ulDNA提取液，沸水浴10分钟，10000rpm离心 5分钟，上清用于扩增反应。 PCR反应：每两人一组其中一人取一PCR反应管，取1步骤离心后的上清2ul，加入PCR反应管底层溶液中，6000rpm离心数秒。另一人取一PCR反应管，取阳性模板2ul加入加入 PCR反应管底层溶液中，6000rpm离心数秒。加好样的PCR反应管放入PCR扩增仪的反应板上，扩增程序：（1）93oC 3分钟预变性（2）三步循环： 93oC 45秒（变性） 55oC 45秒（复性）共35个循环 72oC 1分钟（延伸）（3）72oC 保温5分钟（防止延伸不完整） 3. 电泳检测：直接取PCR反应产物加入2％琼脂糖凝胶上电泳 20分钟，EB染色后在紫外灯下观察，若在314bp 处（与阳性对照处于同一位置）出现条带，则怀疑为HBV阳性。扩增人? – actin特异片段每两人一组，在一0.5离心管中加入以下组分：模板 4ul 引物 2ul dNTPs 1ul Taq酶 0.5ul 10×PCR缓冲液 2.5ul ddH2O 15ul （反应体系为25ul）（所发0.5ml离心管已加好除模板以外的所有组分，请加入4ul昨日所提取的基因组DNA溶液即可进行扩增）扩增程序：（1）94oC 3分钟预变性（2）三步循环： 94oC 45秒（变性） 55oC 45秒（复性）共30个循环 72oC 1分钟（延伸）（3）72oC 保温5分钟（防止延伸不完整）扩增完成后，取8ul反应产物与2ul上样缓冲液混合，在2％琼脂糖凝胶中电泳20分钟（每块胶加一孔DNA Marker做对照），EB染色后在紫外灯下观察，如果扩增成功，在155bp处有条带。 * *