八章园艺植物生物技术4课件教学内容.ppt

园艺植物生物技术;主要内容;第一节 文库筛选;一、园艺植物基因组文库的构建;一、园艺植物基因组文库的构建;2. 载体的选择 a)质粒载体可承载15kb DNA左右片段(有效范围为?10kb) b)?载体可承载25kb DNA左右片段(有效范围为?15kb) c)Cosmid载体可承载45kb DNA左右片段(有效范围为?40kb);3.载体制备 要求:纯度高,去磷酸效果好 去磷酸化是为了提高载体和目标片段的连接效率 纯度如果不高则会在重组克隆中含有大量的细菌基因组DNA,影响文库的质量.;(四) 大片段基因组DNA的制备 要求:一般提取的DNA相对分子量至???应该是文库最终平均插入片段长度的3-5倍 如插入片段达到100kb以上,则要求提取的基因组DNA 分子量要达到500kb以上 实践证明:提取的基因组DNA分子量越大,得到的重组克隆的插入片段越大;基因组DNA 的不完全酶切 1. 根据实验需要选择合择的限制性内切酶 1) 四个识别位点的限制酶出现的几率:1/256 2) 六个识别位点的限制酶出现的几率:1/4096 2. 分离目的酶切片段大小的确定 1)克隆单个基因:?10kb 2)克隆基因族:?20kb;基因组DNA 的不完全酶切 3. DNA不完全酶切条件的确定 1) 确定限制酶用量,改变酶切时间 2) 固定酶切时间,改变限制酶的用量;DNA的不完全酶切;(五)大片段DNA(酶切片段)与克隆载体连接 1. 酶切片段的分离与纯化 1)低熔点琼脂糖回收目的片段 2)试剂盒回收目的片段;(五)大片段DNA(酶切片段)与克隆载体连接 2.克隆载体连接 连接体系中的四种连接方式: 载体自连; 载体和基因组DNA片段连接;基因组DNA片段的自连和基因组片段之间连接 只有基因组DNA和载体之间的连接才是所需要的,如何提高它们之间的连接效率是连接反应的关键. 可以通过调整载体与基因组DNA的比例来达到较好的效果.(载体与外源片段的比例为1:5-1:15);基因组DNA片段3凹端的不完全补平的策略;(六)载体的遗传转化 电转化是转化大肠杆菌使用最普通的一种手段 插入片段越大，转化效率越低 (七)克隆的挑取、验证 从文库中随机挑选一定量的克隆，摇菌，提取质粒DNA，酶切脉冲电泳检查插入片段的大小，并根据数目计算空载率。 细胞器DNA的污染会降低文库的实际容载量，一般用线粒体和叶绿体的探针对文库进行检测。;(八) 文库的扩增、分装及保存 1.基因组DNA文库的保存 1)影印滤膜保存法;(八) 文库的扩增、分装及保存 2.文库在液体培养基中扩增保存 1)从琼脂糖平板上挑取已长出的克隆子转入含适当的抗生素培养基中，混合的细菌生长数代后，其培养物于-70℃储存(加终浓度为25%的甘油). 缺点:因文库菌落生长的不均匀性而导致文库中某些特定的序列过多或过少.;(八) 文库的扩增、分装及保存 2.文库在液体培养基中扩增保存 2) 从平板上挑选单个克隆子接各种于合适的含抗生素的培养基中，菌体生长到一定浓度后，加入终浓度为25%的甘油，于-70℃或-25 ℃下保存 缺点：需要保存的克隆子数过多，工作量大;二、园艺植物cDNA文库的构建;二、园艺植物cDNA文库的构建;mRNA纯化;二、园艺植物cDNA文库的构建;二、园艺植物cDNA文库的构建;二、园艺植物cDNA文库的构建;二、园艺植物cDNA文库的构建;二、园艺植物cDNA文库的构建;合成接头和衔接头;二、园艺植物cDNA文库的构建;cDNA文库构建流程示意图;二、园艺植物cDNA文库的构建;二、园艺植物cDNA文库的构建;(二)新型cDNA文库的构建 2. 标准化cDNA文库 定义:某一特定组织或细胞的所有表达基因均包含其中,且含量相等的cDNA文库。 优点： 增加了克隆丰度极低的mRNA的机会。 能发现普通cDNA探针所不能发现的稀有转录区。 能估计大多数基因的表达水平，并发现组织特异性基因。 ;二、园艺植物cDNA文库的构建;二、园艺植物cDNA文库的构建;二、园艺植物cDNA文库的构建;基因组DNA文库与cDNA文库的比较;基因组DNA文库的优点;cDNA文库的主要优点;cDNA克隆的主要缺点;三、目的基因的筛选;三、目的基因的筛选;三、目的基因的筛选;第二节 图位克隆技术;一、分离基因的程序;一、分离基因的程序;一、分离基因的程序;;;;二、优缺点;第三节 转座子标签法;一、转座子的分类;一、转座子的分类;二、分离基因的程序;三、优缺点;T-DNA标签法;第四节 基因差异表达技术;一、mRNA差异显示技术;一、mRNA差异显示技术;一、mRNA差异显示技术;二、抑制性消减杂交技术;二、抑制性消减杂交技术;二、抑制性消减杂交技术;;二、抑制性消减杂交技术;三、代表性差异分析法;