蛋白质的研究进展.ppt

LCM具有其独特的优点 快速简单、有效减少交叉污染。 样品的切割与分离由激光一步完成，并可以保持被分离的样品的完整性。 结合免疫荧光能够基于组织细胞的表型和功能特征进行分离样品组分。 对制样的要求灵活多样，使用范围较广。 通过LCM对组织切片进行切割与分离可以分离收集从形态上（普通染色），表型或功能上（荧光染色）可以辨认均一性的细胞群体，从而克服了组织不均一的特点，提高了数据的准确性和可靠性，这在肿瘤生物学研究中具有广泛应用。 蛋白质组学研究方法概述 一、蛋白质组表达模式的研究方法 蛋白质组研究中的样品制备 蛋白质组研究中的样品分离 蛋白质组研究中的样品分析鉴定 蛋白质组学研究的生物信息学 定量蛋白质组学研究 二、蛋白质组功能模式的研究方法 蛋白质翻译后修饰的研究 蛋白质相互作用研究技术 （二）蛋白质组研究中的样品分离 双向凝胶电泳(two-dimensional electrophoresis，2-DE)：利用蛋白质的等电点和分子量，结合凝胶化学特性，分离各种蛋白质的方法。 原 理 第1向基于蛋白质的等电点不同用等电聚焦分离，具有相同等电点的蛋白质无论其分子大小，在电场的作用下都会用聚焦在某一特定位置即等电点处；第2向则按分子量的不同用SDS分离，把复杂蛋白混合物中的蛋白质在二维平面上分开。 第一向分离 等电聚焦 蛋白质是两性分子，在不同的pH环境中可以带正电荷、负电荷或不带电荷。对每个蛋白质来说都有一个特定的pH，此时蛋白质的静电荷为零，此pH值即该蛋白质的等电点(pI)。将蛋白质样品加载至pH梯度介质上进行电泳时，它会向与其所带电荷相反的电极方向移动。在移动过程中，蛋白分子可能获得或失去质子，并且随着移动的进行，该蛋白所带的电荷数和迁移速度下降。当蛋白质迁移至其等电点pH位置时，其净电荷数为零，在电场中不再移动。聚焦是一个与pH相关的平衡过程：蛋白质以不同的速率靠近并最终停留在它们各自的pI值；在等电聚焦过程中，蛋白质可以从各个方向移动到它的恒定位点。 第二向分离 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 双向电泳的第二向是将IPG胶条中经过第一向分离的蛋白转移到第二向SDS．PAGE凝胶上，根据蛋白相对分子质量或分子量(MW)大小与第一相垂直的分离。 蛋白质与十二烷基硫酸钠(SDS)结合形成带负电荷的蛋白质．SDS复合物，由于SDS是一种强阴离子去垢剂．所带的负电荷远远超过蛋白质分子原有的电荷量，能消除不同分子之间原有的电荷差异，从而使得凝胶中电泳迁移率不再受蛋白质原有电荷的影响．而主要取决于蛋白质分子的质量大小，其迁移率与分子量的对数呈线性关系，在蛋白质组研究中。需要在同样的条件下同时走多块胶，这对凝胶与凝胶之间的比较十分重要。 特 点 可分离10～100 kD分子量的蛋白质 高灵敏度和高分辨率 便于计算机进行图像分析处理 与质谱分析匹配 双向凝胶电泳(2-DE)技术的缺点 极酸、极碱性蛋白质，疏水性蛋白质，极大蛋白质、极小蛋白质以及低丰度蛋白质用此种技术难于有效分离。 胶内酶解过程费时、费力，难于与质谱联用实现自动化。 新型非凝胶技术 液相色谱法 liquid chromatography，LC 毛细管电泳法 capillary electrophoresis， CE 液相色谱-质谱联用技术（LPLC-MS/MS） 蛋白质混合物直接通过液相色谱分离以代替2-DE的分离，然后进入MS系统获得肽段分子量，再通过串联MS技术，得到部分序列信息，最后通过计算机联网查询、鉴定蛋白质。 根据蛋白质带电性及疏水性不同，用MS分离多肽复合物。离子交换色谱是通过溶质在离子交换色谱固定相上具有不同的保留能力，而实现样品分离的色谱技术，而反相液相色谱是基于溶质疏水性的差异而实现分离的色谱技术。通过这两种色谱模式的联用，可以实现对复杂生物样品的二维分离。 多维色谱技术（LC/LC-MS/MS） 多维蛋白质鉴定技术(multidimensional protein identification technology) 将不同分离模式的色谱柱以串联方式合并于同一根色谱柱中进行，在同一根色谱柱的前半部分装填强阳离子色谱填料，后部分装填反相液相色谱填料，该方法可对样品量较少的蛋白质进行快速分析。 蛋白质组学研究方法概述 一、蛋白质组表达模式的研究方法 蛋白质组研究中的样品制备 蛋白质组研究中的样品分离 蛋白质组研究中的样品分析鉴定 蛋白质组学研究的生物信息学 定量蛋白质组学研究 二、蛋白质组功能模式的研究方法 蛋白质翻译后修饰的研究 蛋白质相互作用研究技术 （三）蛋白质组研究中的样品分析鉴定 传统方法： Edman降解法: