凝胶过滤法分离蛋白质.pdf

实 验 二 凝胶过滤法分离蛋白质 学时：6 一、实验目的： 1、学习凝胶柱层析技术的原理及操作方 法； 2、学习血红蛋白的制备方法。 二、实验原理: 1. 凝胶层析：原理与应用 2. 本实验反应原理：血红蛋白（hemoglobin，Hb）是红细胞 的主要内含物，它是血红素和珠蛋白肽链联接而成的一种 结合蛋白，属色素蛋白。血红蛋白(Mw＝64 500)中加入过 量的高铁氰化钾(K Fe(CN) ，Mw＝327.25)，血红蛋白与 3 6 高铁氰化钾反应生成高铁血红蛋白(MetHb)。为了除去多 余的高铁氰化钾，得到较纯的MetHb样品，将上述混合物 通过交联葡聚糖凝胶柱，用磷酸缓冲液洗脱，从颜色的不 同，可直接观察到MetHb(红褐色)洗脱较快，而小分子高 铁氰化钾(黄色)洗脱较慢，达到将MetHb完全分离出来的 目的。 二、实验材料、试剂和仪器: (一)材料：鸡的抗凝全血 (二)试剂： 1．四氯化碳(CCl4) 2 ．生理盐水 3．交联葡聚糖G-25(细粒) 4 ．0.1mol/L磷酸缓冲液(pH7.0)： a、0.1M磷酸二氢钠；b、0.1M磷酸氢二钠； a、b以49:51 的比例混合，并用pH计校对 5．0.4% K3Fe(CN)6 。 6. 冷生理盐水 (三)仪器(略) 三、实验步骤： • 1．凝胶的处理： 取4克Sephadex-G25干粉，浸泡于蒸 馏水中充分溶胀（室温，6小时），然后倾 斜法除去表面悬浮的小颗粒，最后加入等 体积pH7磷酸缓冲液继续浸泡。 • 2 ．装柱 取玻璃层析柱(25cm ×1.5cm)一支，垂直装好。加入缓冲 液，打开出口，将气泡赶出，关闭出口。 从管顶向柱内加入缓冲液8cm左右高，将平衡后的凝胶悬 浮液边搅拌边用滴管加入柱内，同时打开出口，使液体流 出，继续不断地加入凝胶悬浮液，柱内凝胶柱床沉积至高 20cm左右时为止。 床面上覆盖3ml缓冲液，关闭出口，在凝胶柱面上加盖一 层圆形滤纸，使层析柱稳定5～10min后，接蠕动泵，打 开出口，用2倍于床体积的磷酸缓冲液洗脱平衡，最后关 闭出口。 • 3．样品处理 血红蛋白溶液的制备 取草酸盐抗凝全血3ml离心，吸去上 层血浆，加入5倍体积的冷生理盐水，混匀后3 000r/min 离心5min，弃去上清液，重复3次。最后一次吸去上清液 后，在红细胞层上面加等体积蒸馏水，振摇。再加1/2体 积CCl4 ，用力振摇3min，3 000r/min离心5min 。吸取上层 澄清的血红蛋白液备用。此溶液中Hb浓度约为10%(置4 ℃ 暂存，一周用完)。 样品 血红蛋白液3滴加K3Fe(CN)6 8滴和蒸馏水2滴混合， 制成MetHb混合样品。 • 4 ．上样、洗脱 打开平衡好的层析柱出口，使柱内溶液流出至 刚露出柱床面时即关闭出口。 吸混合物样品0.5ml左右，在距离床面1mm处沿 管内壁轻轻转动加进样品，切勿搅动床面。然 后打开出口，使样品进入床内，直至床面重新 露出。 加入1～2倍样品量体积的洗脱液(这样可以使样 品定容至最小，而样品又完全进入床内)，当少 量洗脱液将流入床面时，加入多量的洗脱液， 但注意切勿搅动床面凝胶，连接蠕动泵进行洗 脱。 • 5．分部收集 用自动部分收集器，以5滴/min ， 5min/管的速度进行收集。并且观察柱上的色带，待 黄色的K Fe(CN) 色带完全洗脱下来后，再继续收 3 6 集两管透明的洗脱液作为空白，关闭出口。 • 6．测定: 两种方法 – 接紫外检测仪及记录仪，绘制280nm洗脱图谱。 – 将每管收集液加入缓冲液至4ml ，混匀，在425nm处测其 吸光度，以吸光度为纵坐标，管数为横坐标，