《第三章基因工程药物23节3766775》-公开课件.ppt

基因工程制药（2） 上次课内容的回顾(1) 基因工程对药物改造的应用实例 利用基因工程生产药物的优点 上次课内容的回顾(2) 利用基因工程技术生产药品有什么优点？ ①大量生产过去难以获得的生理活性蛋白和多肽； ②可以提供足够数量的生理活性物质，以便进行深入的研究 ③可以发现、挖掘更多的内源性生理活性物质； ④内源生理活性物质在作为药物使用时存在的不足可以改造； ⑤利用基因工程技术可获得新型化合物，扩大药物筛选来源。 基因工程制药 1982年第一个基因工程产品--人胰岛素在美国问世。 第三节 基因工程药物生产 的基本过程 基因工程技术是将重组对象的目的基因插入载体，拼接后转入新的宿主细胞，构建成工程菌(或细胞），实现遗传物质的重新组合，并使目的基因在工程菌内进行复制和表达的技术。 基因工程基本过程 基因工程制药的主要程序 ⒈ 目的基因的克隆 ⒉ 构建DAN重组体 ⒊ DAN重组体转入宿主菌 ⒋ 工程菌发酵 ( 发酵罐1；2 ) 5.表达产物的分离纯化 6.产品的检验等 制备基因工程药物的一般程序 获得目的基因 下游阶段是将实验室成果产业化、商品化，它主要包括工程菌大规模发酵最佳参数的确立，新型生物反应器的研制，高效分离介质及装置的开发，分离纯化的优化控制，高纯度产品的制备技术，生物传感器等一系列仪器仪表的设计和制造，电子计算机的优化控制等。 工程菌的发酵工艺不同于传统的抗生素和氨基酸发酵，需要对影响目的基因表达的因素进行分析，并对各种影响因素进行优化，建立适于目的基因的高效表达发酵工艺，以便获得较高产量的目的基因表达产物。为了获得合格的目的产物的产品，需要建立一系列的、相应的分离纯化、质量控制、产品保存等技术。 生物制药中所用菌种的获得途径： 诱变育种 基因工程构建 细胞工程 自然界分离 一、构建过程示意图 第四节 目的基因的获得 应用基因工程技术生产新型药物，首先必须构建一个特定的目的基因无性繁殖系，即产生各种新药的不同的基因工程菌株。来源于真核细胞的产生基因工程药物的目的基因，是不能进行直接分离的。所以，需要采用一些技术获得真核细胞的基因用于新型药物的合成。 克隆真核基因的方法 克隆真核基因常用方法：逆转录法和化学合成法，RT-PCR。 一、逆转录法 逆转录法就是先分离纯化目的基因的 mRNA，在反转录成 cDNA，然后进行 cDNA 的克隆表达。 为了克隆编码某种特异蛋白质多肽的DNA序列，可以从产生该蛋白质的真核细胞中提取mRNA，以mRNA为模板，在逆转录酶的作用下，反转录合成该蛋白质mRNA的互补DNA(cDNA的第一链)，再以cDNA第一链为模板，在逆转录酶或DNA聚合酶Ⅰ (或者Klenow酶大片段)作用下，最终合成编码该多肽的双链DNA序列。 cDNA克隆示意图 一、逆转录法步骤 ⒈ mRNA的纯化 ⒉ cDNA第一链的合成 ⒊ cDNA第二链的合成 ⒋ cDNA的克隆(载体) ⒌ 将重组体导入宿主细胞 ⒍ cDNA文库的鉴定 ⒎ 目的cDNA克隆的分离和鉴定 二、RT-PCR法 1985年聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)创立后，将它与逆转录方法结合起来，得到一种新的合成cDNA的方法， 即逆转录—聚合酶链反应法（RT-PCR）。 该方法是mRNA逆转录合成cDNA第一链，不需再合成cDNA第二链，而是在特异引物协助下，用PCR法进行扩增，特异地合成目的cDNA链，用于重组、克隆。 具备的条件： 较小的蛋白质或多肽的编码基因可以用化学合成法合成。 必须知道目的基因的核苷酸顺序或目的蛋白质的氨基酸顺序。 三、化学合成法（2） 用化学法合成目的基因DNA不同部位的两条链的寡核苷酸短片段，再退火，成为两端形成粘性末端的DNA双链片段，然后将这些双链片段按正确的次序进行退火使连接成较长的DNA片段，再用连接酶连接成完整的基因。 人工化学合成基因的限制（1） ⒈ 不能合成太长的基因。目前 DNA 合成仪所合成的寡核苷酸片段为 50～ 60 bp，因此只适用于克隆小分子肽的基因。 人工化学合成基因的限制（2） ⒉ 遗传密码的简并使选择密码子困难，用氨基酸顺序推测核苷酸序列，得到的结果可能与天然基因不完全一致，易造成中性突变。 ⒊ 费用高。 四、其他方法 1、编码序列富集法 2、岛屿获救PCR法 3、动物杂交法 4、功能克隆法 5、构建cDNA文库 6、差异显示技术的应用 7、对已发现基因的改造 1、编码序列富集法 利用磁场力对cDNA文库中的目的基因进行富集的一种技术。将质粒DNA库用识别位点较多的酶酶切后连