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乙肝病毒YMDD变异和1896位点变异的检测 病毒变异是生物遗传进化的基本因素之一。乙型肝炎病毒（HBV）变异是在慢性感染过程中为适应生存环境而自然发生的，也可发生于应用药物或接种疫苗后。已发现HBV序列的变异在基因组各个区域均可发生。 通常把病毒株分为野毒株（wide?strain）和变异株（variation?strain）。变异株即发生了突变、插入或缺失、移框突变等变异的病毒株。一些变异株对临床预后和病毒学反应具有重要意义 。 乙肝病毒常见的变异： 前C/C基因变异?: 1896位的变异和1899位的变异 P基因变异: 拉米呋啶引起YMDD变异 X基因的变异 前S/S基因变异 乙肝病毒YMDD变异 是由于长期使用拉米呋啶 (Lamivudine,? LAM)做抗乙肝病毒治疗,使HBV P区编码的DNA聚合酶基因在739或741位点发生突变,其编码的HBV逆转录酶活性部位YMDD发生了改变。 YMDD变异通常有2种形式: 一种为P区741位鸟嘌呤被胸腺嘧啶取代(G→T)，则其编码的550位的蛋氨酸变为亮氨酸(YMDD→YIDD); 另一种为第739位腺嘌呤被鸟嘌呤取代(A→G)，则其编码的550位的蛋氨酸变为缬氨酸(YMDD→YVDD）。 YMDD变异的意义: YMDD结构域是HBV进行逆转录的生物活性部位，也恰恰是拉米夫定干扰HBV复制的药物结合位点，这2种变异均导致了拉米夫定与多聚酶亲合力的下降或消失 ，而导致对拉米夫定的耐药。体外实验证实，YMDD变异株对拉米夫定的敏感性降低为野生株的万分之一 。 YMDD变异的检测 使用试剂： 杭州博赛基因诊断技术有限公司的“乙型肝炎病毒核酸荧光定量检测及YMDD变异检测试剂盒”。于2005年7月中旬获得国家药监局授予的新药证书。国药证字 该产品有以下优点 1. 国内唯一一款获得批准文号的检测YMDD变异诊断试剂； 2. 国内唯一一款实现HBV DNA定量与YMDD变异双检功能的试剂； 3. 闭管检测：直接在反应管中对PCR扩增产物进行荧光数据采集和分析； 4. 结果判断简捷、明确：通过双色荧光通道检测所得Ct值可直接分辨出是否发生YMDD变异； 试验原理 采用乙型肝炎病毒特异引物，利用核酸扩增、荧光标记探针，结合Taqman MGB技术，对人血清或血浆中乙型肝炎病毒核酸（HBV DNA）定量检测，同时对YMDD位点变异进行检测。 操作步骤 1.样本采集：抽取病人静脉血 2.0ml，取血清0.2ml送检。血清标本在2~8℃可放置72小时，-70 ℃可长期保存，标本不宜反复冻融。 2.样本、对照品的处理和加样 3.PCR扩增 4.结果判断 结果判断 Ct值 结果判断 A管Ct＞38, B管Ct＞38 HBVDNA阴性 A管Ct≤38, B管Ct≤38 YMDD野生型 A管Ct≤38, B管Ct＞38 YMDD变异型 结果判断 蓝:A管曲线 红:B管曲线 野生型 结果判断 蓝:A管曲线 红:B管曲线 变异型 干扰素耐药的原因 ①免疫耐受：母婴垂直传播HBV感染后，机体免疫系统发育阶段与HBV感染相伴随，误将HBV认作自身成分，而难以发挥排斥清除反应。 ②病毒基因变异：主要是第1896位点变异，这种变异株对干扰素治疗不敏感。 ③基因整合：病毒基因整合在细胞内，难以清除，可在停药后复制、表达，造成反跳和复发。 ④干扰素抗体：机体可能对外源性的干扰素产生中和抗体，降低干扰素疗效。 前C区1896位点变异 是HBV中最常见的变异。1896型突变株可逃逸机体的细胞免疫，干扰素治疗不敏感,增强病毒基因组的包装，病毒复制增强，致病性增加。迅速及时进行A1896位点突变检测，可以帮助医生诊断HBeAg阴性是由于HBV突变还是一种康复表现。 帮助确定干扰素的治疗。 HBV1896位点变异检测 使用杭州博赛基因诊断技术有限公司的“乙型肝炎病毒1896位点变异荧光PCR检测试剂”。其原理、操作与YMDD变异试剂基本相同。 结果判断 Ct值 结果判断 A管Ct＞38, B管Ct＞38 HBV阴性 A管Ct≤38, B管Ct≤38 1896野生型 A管Ct≤38, B管Ct＞38 1896变异型 200６.09 谢 谢 知识回顾Knowledge Revie