免疫原及抗血清及制备多媒体.ppt

基本要求： 掌握：免疫原、抗血清的制备过程。 掌握：抗血清的鉴定方法、抗血清的纯化方法 抗原抗体是免疫学检测的重要因素。 抗原纯化是制备特异性抗体的先决条件。 制备高效价高特异性的抗血清必须有理想的免疫原。 通过抗血清的制备而获得特异性的抗体可用于纯化抗原和检测或鉴定抗原。 抗体有来自单克隆抗体、免疫动物的多克隆抗体和基因工程的抗体。 颗粒性抗原的制备 颗粒性抗原包括人和各种动物细胞抗原以及各种细菌抗原和寄生虫体抗原。 细胞抗原：（绵羊红细胞）一般情况下经生理盐水洗净，配制一定浓度的细胞悬液，即可应用。 免疫原的制备 细菌抗原多用液体或固体培养物，经集菌后处理。 鞭毛抗原需用0．3%~0．5%的甲醛处理；菌体抗原加温100℃2~2．5h去除鞭毛抗原；毒素抗原则在杀菌后再加0．5%~1．0%氯化钙溶液等。 颗粒抗原大多用静脉内注射免疫法，较少加佐剂作皮内注射。 二、可溶性抗原的制备和纯化 蛋白质、糖蛋白、细菌毒素、酶、补体和核酸都是良好的可溶性抗原。 这些蛋白质多为复杂的蛋白组成，免疫前需进行纯化。 二、可溶性抗原的制备和纯化 高速组织捣碎机法： 将组织加盐水装入捣碎机筒内，间断进行离心，每次30到6 0分钟，时间过长会导致产热。 研磨法： 用玻璃均浆器或乳钵研磨，经过旋转、压挤将组织粉碎。 组织均浆液要离心沉淀，沉淀物组织和细胞碎片，上清液为提取可溶性抗原的材料。 二、可溶性抗原的制备和纯化 组织细胞或培养细胞可溶性抗原的制备 制备抗原的细胞包括正常的细胞、传代细胞或肿瘤细胞。 细胞抗原一般分为三个部分：膜蛋白抗原、细胞质抗原（细胞器）和细胞核与核膜抗原。 反复冷冻法：将细胞或整块组织置-20℃冰箱内冻结，然后置室温融化，如此反复两次，大部分组织细胞及细胞内的颗粒可冻融破碎。 超声破碎法：利用超声波机械振动的原理使细胞破碎。常用于处理微生物和组织的细胞。 自溶法：利用组织和微生物的自身酶系统，在一定PH和温度下，使其细胞裂解。 酶处理法：溶菌酶、蜗牛酶、纤维素酶等，在一定的条件下能消化细菌和组织细胞。 表面活性剂处理法：常用十二烷基硫酸钠等表面活性剂处理。 超速离心分离法 常用于分离亚细胞成分及大分子蛋白。 差速离心法：用于分离大小差异较大的抗原颗粒 梯度密度离心法：区带分离法，通过梯度密度离心，使各类分子量的颗粒分离。（梯度柱）。 选择沉淀法 采用各种沉淀剂或某些条件促使抗原成分沉淀的方法。 核酸去除法：可采用氯化锰、硫酸鱼精蛋白等核酸提取沉淀剂，而核糖核酸降解法更简单（采用DNA或RNA酶） 有机溶剂沉淀法：使用的有机溶剂多为乙醇或丙酮。 选择沉淀法 盐析沉淀法 经典的蛋白质纯化分离技术 抗原的初筛：用不同饱和度的硫酸钠或硫酸铵使蛋白抗原进行初筛。 提取丙种球蛋白:（IgG95%以上）将33%~50%饱和度硫酸胺沉淀物经去盐后可直接用于抗体试剂。 抗原的浓缩：通过加入硫酸铵，将其沉淀下来，以利于进一步纯化。 凝胶过滤 分子筛层析，具有三维空间 多孔网状结构的物质。 将含多种分子量的样品溶液 缓慢流经凝胶柱时，各分子 在柱内进行两种不同运动， 垂直向下移动和无定向扩散运动。 通过凝胶分子筛作用，大、中、 小三类分子彼此较易分开。 离子交换层析 离子交换层析是利用一些带电离子集团的凝胶或纤维素，吸附带有相反电荷的蛋白质抗原。 1、具有离子交换集团的纤维素。 2、具有离子交换集团的交联葡萄糖、琼脂糖和聚丙烯酰胺。 3、被覆以离子化物质的细粉。 4、凝胶合成的高度交联树脂。 亲和层析 是利用生物大分子的生物学特异性，即生物分子间具有的专一性亲和力的层析技术。 在一定条件下，二者能紧密结合成复合物，如将复合物的已知一方固定在固相载体上，则可从溶液中专一性地分离和提纯另一方。 亲和层析 抗原或抗体与支持物的结合 将抗原或抗体结合到支持物上的方法达数十种，可归纳为载体结合法、物理吸附法、交联法和网络法。 结合法的步骤是先活化支持物上的功能集团，抗原抗体连接到这些活化的集团上。 制备菌体抗原的方法是 A 100℃加温2小时 B 0.5%甲醛 C 75%乙醇 D 1%氯化钙 E 2％氯仿 分离亚细胞成分最常用的方法是 A 凝胶过滤法 B 低速离心法 C 超速离心法 D 选择性沉淀法 E 高速离心法 配制绵羊红细胞免疫原一般细胞浓度为 A 103∕ml B 104∕ml C 105∕ml D 106∕ml E 107∕ml 颗粒性抗原免疫接种的方法通常采用 A 皮下注射