实验二：ERIC-PCR指纹图谱技术.pptVIP

实验二  ERIC-PCR指纹图谱技术 在分子生态学中的应用 实 验 目 的 明确ERIC-PCR技术用于分析微生物群落结构的原理。 掌握ERIC-PCR的操作方法。 ERIC (Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus)-PCR PCR反应的一般原理 PCR: 聚合酶链式反应，即通过引物延伸核酸的某个区域而进行的重复双向DNA合成。 基本要素： DNA模板 一对寡聚DNA引物（启动DNA扩增） Taq DNA聚合酶（催化DNA合成） 缓冲液（提供DNA合成所需pH、离子强度等环境） dNTP（DNA合成的原料） ERIC-PCR程序 95℃, 7min 94℃, 1min (变性) 52℃, 1min (退火) 30 cycles 68℃, 8min (延伸) 65℃, 16min 实 验 材 料 2. 仪器设备 实 验 步 骤 制备PCR mixture (25μl system) 无菌水 13 μl 10× buffer 2.5μl 25 mmol/μl MgCl2溶液 2.0μl 2.5 mmol/L dNTP混合液 2.0μl 20pmol/L 引物E1 0.5μl 20pmol/L 引物E2 0.5μl 加入模板DNA（40ng） 4.0μl 放入PCR扩增仪，95℃变性7min 取出PCR小管，迅速加入0.5μl Taq DNA聚合酶，混匀，简短离心。（后加酶可保证模板变性完全且不损坏Taq DNA聚合酶的活性） 程序结束（约6.5h),取出PCR小管 吸取2μl扩增产物用浓度仪测定浓度 注 意 事 项 避免污染 PCR体系中所有试剂必须保证无其它杂菌DNA的污染。 制备PCR混合物的操作应在超净台上进行。 打开PCR扩增小管时切勿用手指接触管盖内侧。 用移液器吸取试剂时要轻吸轻放。 定量 模板DNA的量一致 电泳时PCR产物上样量一致 * Hulton,1991 首次在肠道细菌基因组中发现ERIC序列 Versalovic,1991 发明ERIC-PCR，对细菌的基因组DNA进行指纹图分析 Gillings,1997b ERIC-PCR可以从植物、动物、真菌等的基因组DNA中扩增出稳定的、多态性丰富的图谱。 Gillings,1997a ERIC-PCR不只针对ERIC序列，实际上是一种“长引物随机PCR (LP-RAPD)” Di Giovanni, 1999 用ERIC-PCR分析混合菌群的组成 高平平,2003 Wei,2004 将ERIC-PCR方法引入复杂环境微生物群落的研究 ERIC-PCR是一种长引物随机PCR技术 退火温度高于52℃ 退火温度低于40℃ 单个或一对长度大于16bp的引物 引物常为8-10bp的单个引物 LP-RAPD 普通RAPD 图谱稳定、重复性高，对底物的序列差异敏感性高，产生的图谱多态性丰富 PCR原理 1. 试剂 无菌水 25 mmol/L MgCl2溶液 10×扩增缓冲液: 含500 mM KCl, 100 mM Tris-HCl (PH9.0), 1% TritionX-100 2.5 mmol/L dNTP混合液 20pmol/μl 引物E1 20pmol/μl 引物E2 5 U/μl Taq DNA聚合酶 DNA模板（40-80ng环境样品总DNA） 20.5 μl 24.5 μl NC 样品 PC 5. 放入PCR扩增仪 ，按以下程序进行扩增： 94℃ 1 min，52℃ 1 min, 65℃ 8 min，共30个循环； 65℃延伸16min，1个循环。 8. 400ng PCR产物电泳 9. 凝胶成像，保存图谱 Mr NC S PC 结果：