细胞相关生物学行为分析方法2003.pptxVIP

第三讲 细胞相关生物学行为分析方法 Methods for the research of cell behaviors 一、细胞增殖(proliferation)动力学检测方法二、细胞凋亡(apoptosis)检测技术三、细胞侵袭/迁移(invasion/migration)检测技术四、细胞生物力学特性(biomechanics)检测技术一、细胞增殖动力学检测方法培养中，细胞的生长、繁殖(proliferation)和死亡(death)是一个动态的过程，细胞增殖动力学是描述细胞状态的一项重要指标。(1)生长曲线(growth curve)的测定：记录细胞的绝对生长数值，了解细胞总体的(global)增殖生长规律。(2)分裂指数的测定：记录细胞群体中分裂期细胞(cell at mitotic phase)所占百分比，用以表示细胞增殖旺盛程度。(3)细胞增殖指数：新增殖(newly generated )的细胞占细胞总数的百分比。(4)集落（克隆）形成实验：测定单个细胞(single cell)增殖能力。一、细胞增殖动力学检测方法 (1)生长曲线的测定在培养瓶或孔板中准确接种相同数量的细胞，每天计数(count everyday)，测出培养瓶或孔板中的细胞总数，持续7天（也可根据需要而定）。细胞接种量以7天能长满，而不发生接触抑制(contanct inhibition)为度。对比生化、物理刺激、基因改造前、后细胞生长特性的差异反映细胞生长特性：对数生长期（传代）、倍增时间(doubling time)等一、细胞增殖动力学检测方法 (1)生长曲线(growth curve)的测定细胞计数法(cytometry)血球计数板Tips:(1)数上不数下，数左不数右；(2)每一大方格细胞数×104=细胞数/mL(3)可用台盼蓝(trypan blue)染色区分活、死细胞0.01cm2×0.01cm=0.1mm3一、细胞增殖动力学检测方法 (1)生长曲线的测定MTT（四唑盐）法酶标仪摇床96孔板原理：活细胞线粒体(mitochondrion)中脱氢酶(dehydrogenase)能将四唑盐还原成不溶干水的蓝紫色产物甲臜（formazan)，并沉淀在细胞中。二甲亚砜（DMSO）能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与所含的formazan量成正比。用酶标仪(microplate reader)测定OD值即可获得间接的细胞数量表征。特点：快速，准确，可一次处理多个样品。由于脱氢酶非细胞数量的直接表征，常被审稿人诟病。类似方法：WST、MTS、XTT、CCK8等。一、细胞增殖动力学检测方法 (1)生长曲线的测定XTT法原理：XTT是异种与MTT类似的四唑氮衍生物，可被活细胞线粒体脱氢酶还原成水溶性的棕色(brown)甲肷产物，当XTT与电子耦合剂（PMS）共同使用时，甲肷的生成量与细胞的增殖程度呈正相关。MTS法原理：与MTT法原理类似。MTS是MTT的类似物，能被活细胞线粒体中脱氢酶还原成可溶于水的有色产物甲臜盐，可直接进行比色。特点：步骤相对MTT更简单，相对更准确。WST-1法原理：与MTS原理类似。检测范围宽于MTT和MTS。CCK8法原理：基于WST-8。在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的脱氢酶还原生成高度水溶性的橙黄色的甲臜产物。颜色的深浅与细胞的增殖成正比。使用酶标仪在450mM波长处测定OD值，间接反映活细胞数量。 一、细胞增殖动力学检测方法 (1)生长曲线的测定各种细胞增殖/毒性检测方法的优势比较一、细胞增殖动力学检测方法 (2)分裂指数(mitotic index)测定于细胞培养载玻片上进行，定时取出玻片进行固定染色，并观察计数，也可将数据绘制成曲线。细胞培养载玻片骨髓细胞Giemsa染色细胞分裂过程荧光染色一、细胞增殖动力学检测方法 (3)BrdU掺入法测定细胞增殖指数5-溴脱氧尿嘧啶核苷是胸腺嘧啶的衍生物，可以通过与胸腺嘧啶竞争掺入到S期细胞单链DNA中，再利用抗BrdU单克隆抗体显示增殖细胞核。通常用DAPI和BrdU荧光染色复染的方法来分析细胞的增殖情况。BrdU competes with thymine in the synthesis of DNA during proliferation. BrdU掺入法根据选择抗体标记物的不同，还可以通过免疫组化(IHC)、流式细胞术(FACS)、ELISA检测细胞的增殖情况。同类方法：EdU法Anti-BrduDAPI一、细胞增殖动力学检测方法 (4)集落形成(colony forming)实验单个细胞在体外持续生长，其后代所形成的细胞群称为克隆或集落。该方法可对单个细胞的增殖潜力做定量分析，也常用来确定抗癌药物对肿瘤的杀伤能力。常用的方法包括平板集落形