人类基因组dna提取.pptxVIP

人类基因组DNA提取、限制性核酸内切酶切割的原理、方法、琼脂糖凝胶电泳结果分析及其应用;;提取方法: 1·从全血中提取 2·从口腔上皮脱落细胞，发根细胞中提取;(全血）原理：;（全血）操作方法： 细胞裂解与RNase/蛋白酶K 消化 　　1. 取100 μl抗凝全血置于1.5ml Eppendorf离心管中，再加入100 μl裂解液和20 μl RNaseA/蛋白酶K液，用移液器来回吹打混匀，室于55℃温浴35分钟，其间来回颠倒离心管几次，直至溶液呈水溶状。 　　2. 加入10μl 3M的NaAc(pH 4.8)，随后加入1250 μl结合缓冲液，充分振荡混匀，12，000 rpm离心30秒。;; DNA的纯化: 4. 再加入600 μl洗涤缓冲液（washing buffer）到离心吸附柱（套好收集管）中，12，000 rpm 离心30秒。 　　5．重复步骤4一次，12，000 rpm 离心3分钟以充分除去洗涤缓冲液。 　6．小心取出离心吸附柱，弃收集管，将离心吸附柱套入一个干净的1.5ml Eppendorf 离心管，并加入50 μl洗脱缓冲液(elution buffer) 到离心吸附柱中(洗脱缓冲液一定要加在离心吸附柱的正中)，放置1分钟，于12，000 rpm 离心30秒。 　　7．取出Eppendorf 离心管，其中便是所提取基因组NA。;（口腔上皮脱落细胞）原理 哺乳动物的一切有核细胞都可以用来制备DNA,除特殊要求外，白细胞，肝或脾组织是最常用的的材料。原始材料较少或较难获得时（如羊水细胞），还必须经过细胞培养来获得足够量的细胞，有时为了简易，还可以无创伤的采集材料，如用口腔上皮脱落细胞，发根细胞。产前诊断所用的材料则为胎儿的羊水细胞或绒毛膜细胞； ;（口腔上皮脱落细胞）操作方法： 1、用舌头舔颊粘膜上颚、用牙刮颊部，嘬咀，用分泌出的唾液反复漱口；将唾液吐到杯中。用生理盐水洗涤，2000rpm离心10分钟，倒掉上清液；重复1次。 2、沉淀中加1ml 1×细胞核裂解液(STE)，打散细胞团、混匀，再加酶解混合液（含350μl STE、150μl 10% SDS和10μl 20mg/ml蛋白酶K），摇匀，至出现粘稠透明状。37℃温箱过夜或50℃3~4小时。;;6、将上清移入另一离心管中，沿离心管壁向DNA溶液中加入2.5倍体积的无水乙醇，轻轻摇动离心管混和至体系完全均一，见白色絮状DNA。用移液器吸头挑出DNA沉淀，在新配制的70%乙醇洗二次，室温干燥5分钟，再将DNA溶于20-100μl TE中。 7、TE溶解的DNA，在4℃下可保存一年，如要求长期保存，则需加2倍体积无水乙醇置-70℃保存。;;一、概念;二、分类; 切割位点;三、作用机制;四、切割方法;黏性末端;平末端 有一些酶沿对称轴切断DNA，产生的末端称为平端或钝端 例如:SmaI;同工异源酶 来源不同的酶，但能识别和切割同一位点 如BamH I 和Bst I(G↓GATCC) 同尾酶 有些限制性内切酶识别序列不同，但是产生相 同的黏性末端。 如BamH I（G↓GATCC）和 Sau3A I(N↓GATCN) ;;琼脂糖凝胶电泳结果分析;;琼脂糖凝胶电泳原理;琼脂糖凝胶电泳原理:;;1)核酸的分子量;2）核酸构型 ;;;;;;;琼脂糖凝胶电泳注意点; 缓冲液: 常用的缓冲液有TAE和TBE，而TBE比TAE有着更好的缓冲能力。使用新制的缓冲液可以明显提高电泳效果。 注意：电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，pH值上升，缓冲性能下降，可能使DNA电泳产生条带模糊和不规则的DNA带迁移的现象。 ;; DNA电泳一定要使用DNA Marker或已知大小的正对照DNA来估计DNA片段大小。Marker应该选择在目标片段大小附近ladder较密的，这样对目标片段大小的估计比较准确。需要注意的是Marker的电泳同样要符合DNA电泳的操作标准。 ;核酸染色剂;DNA样品的纯度和状态;;琼脂糖凝胶电泳操作步骤;琼脂糖凝胶电泳的应用;实验结果观察及记录;谢谢观赏