第五讲_基因定点诱变_PCR技术.ppt

RT－PCR: 在mRNA反转录之后进行的PCR 检测RNA分子； 获取测序模板DNA； 克隆mRNA之cDNA拷贝。 知识回顾Knowledge Review 祝您成功！ 基因的定点诱变 概念： 定点诱变：通过取代、插入或缺失克隆基因或DNA序列中的任何一个特定的碱基的技术。 M.Smith（加拿大生物化学家） 1993年诺贝尔化学奖，1978年发明了寡核苷酸定点诱变技术。 利用寡核苷酸定点诱变技术，可以认为地通过基因的改变来修饰、改造某一已知的蛋白质，从而可以研究蛋白质的结构及其与功能的关系、蛋白质之间的相互作用。 寡核苷酸定点诱变技术 基因诱变的应用 1 结构和功能 2 基因的注释 3 代谢途径-分子育种 4 蛋白质的修饰 5 分子设计-分子进化工程 缺失诱变 1 简单缺失 通过对DNA片段中具有的相应的酶切位点进行切割，而后用T4连接酶进行连接。 2 系统缺失 核酸外切酶III、S1核酸酶、Klenow大片段 插入突变 1 人工合成片段 2 Transposon insertion （Tn5） 3 同源重组 4 PCR 基因的体外诱变 Kunkel法 或称”U”法 dut -：dUTP酶（dUTPase）缺陷，细胞不能把dUTP转化为dUMP,因此细胞内dUTP的含量大为增加，其中一些dUTP可掺入DNA中正常情况下有“T”占据的位置。 ung -：UDG酶缺陷，UDG酶（尿嘧啶-N-糖基化酶）可除去DNA中的尿嘧啶 E.Coli （dut-，ung-） 合成的DNA中含有尿嘧啶，M13噬菌体DNA中将含有20-30个尿嘧啶碱基。 CJ236(dut-，ung- ，F+ ) ssDNA制备载体 1 单链噬菌体载体 M13 2 phagemid载体-辅助噬菌体 所用酶类 T4噬菌体聚合酶：诱变几率65% T7噬菌体聚合酶：3‘-5’外切活性强，持续合成DNA的能力强，遇到引物时会停止。诱变几率83% KlenowDNA聚合酶：前端有引物或双链时，可能会替换。诱变几率36% 影响因素 1 引物：热动力学（配对），突变碱基的左右8-10bp 2 T4连接酶 3 5’端磷酸化 4 单链结合蛋白：解决颈环结构 基因扩增（gene amplification） 主要内容： 1.体外扩增 2.通过体外重组和转化，将目的基因在宿主细胞进行扩增 3.在环境作用下，生物体内相关基因的扩增。 4.程序基因扩增 5.进化过程中的基因扩增 PCR技术 在1983年，美国Cetus公司人类遗传研究室的科学家K.B.Mullis发明的。 PCR是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，有称之为体外扩增法。 (c) (b) 引物2 5’ 3’ 3’ 3’ 5’ 5’ (d) 新引物 5’ 3’ 靶DNA的扩增 (a) 5’ 3’ 引物1 3’ 5’ 3’ 5’ 引物2互补链 引物1互补链 单位长度的链 不同长度的链 5’ 3’ 3’ 5’ 引物1互补链 引物2互补链 目的片段（不同长度的链未示出） 聚合酶链式反应示意图 (e) (f) (g) 温度（℃） 时间（min） 94 72 60 94℃变性（1min） 60 ℃退火（1min） 72 ℃延伸（1.5min） 循环1 循环2 循环3 PCR反应的温度循环周期 PCR 反应的每一个温度循环周期都是由DNA变性、引物退火和反应延伸三个步骤完成的。图中设定的反应参数是94℃变性1min， 60 ℃退火1min， 72 ℃延伸1.5min。如此周而复始，重复进行，直至扩增产物的数量满足实验需求为止。 Reaction Condition for a Typical PCR Assay Typical PCR Thermal Profile *This cycle is normally included in a PCR assay in order to allow any “unfinished” product from previous amplification to achieve its full length Some DNA Polymerases Used in PCR Characteristics of Taq Polymerase PCR引物： 与待扩增的靶DNA区段两端序列互补的人工合成的寡核苷酸片断。 1.其长度通常在15~30个核苷酸之间。 2.简并引