蛋白质的通性纯化和表征.pptxVIP

第三章;一、蛋白质的酸碱性质 二、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀 三、蛋白质分离纯化的一般原则 四、蛋白质的分离纯化方法 五、蛋白质相对分子量的测定 六、蛋白质的含量测定与纯度鉴定 ;本 章 重 点;一　蛋白质的酸碱性质; 每种蛋白质都有它特有的等电点，这也是鉴别蛋白质的指标之一。;3. 等离子点;二 蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀 ; 由于蛋白质分子很大，在水中形成胶体溶液。蛋白质主要是指球状蛋白质，它的亲水基团都在表面，因此与水有很大的亲和力，成为亲水胶体。 ;稳定亲水胶体的因素： 水化膜 表面电荷; 当破坏了维持蛋白质胶体稳定的因素甚至蛋白质的构象时，蛋白质就会从溶液中析出，这种现象称为蛋白质的沉淀。;;(1) 盐析法( salting out);(2) 有机溶剂沉淀法;重金属离子如Cu2+、Hg2+、Ag2+、Pb2+等带有正电荷，能与蛋白质分子中带负电的基团结合，生成不溶性的重金属蛋白盐而沉淀。;生物碱试剂(如鞣酸、苦味酸、钨酸等)，某些酸类(主要是指三氯醋酸、磺酰水杨酸和硝酸等)，与带正电的蛋白质 结合生成不溶性的盐而沉淀。;（5）加热变性;（一） 纯化的总目标 （二） 蛋白质分离纯化的一般原则 ;（一）目的 ;1、总目标 ;2、分离提纯的一般程序 ;第一步：前处理 ;①将组织和细胞破碎 动物组织和细胞：电动捣碎机 匀浆器 超声波处理 植物组织和细胞：石英砂+提取液，研磨 纤维素酶处理 细菌：超声波震荡、与砂研磨、高压挤压、溶菌酶处理 （分解肽聚糖） ②差速离心法收集细胞的某一组分 （differential centrifugation) ;第二步：粗分级 ; 第三步：细分级 ; 电泳;四 蛋白质的分离纯化方法 ;（一）根据分子大小不同的纯化方法 ;不同分子量的蛋白质分子;1 透析和超滤;透析与超过滤简易装置;超滤装置;（1）凝胶过滤的介质;凝胶的网孔大小决定分离范围; 常用的凝胶 : 葡聚糖凝胶（商品名Sephadex） 是由线型的α-1,6-葡萄糖与1-氯-2,3-环氧丙烷反应而成,商品名为Sephadex 。 聚丙烯酰胺凝胶(商品名Bio-GelP) 是由单体丙烯酰胺和交联剂甲叉双丙烯酰胺共聚而成，商品名为Bio-Gel P。 琼脂糖凝胶(Sepharose，Bio-gel A) 是从琼脂中分离制得的，商品名为Sepharose或Bio-Gel A ;交联葡聚糖凝胶 Sephadex;;以甲叉双丙烯酰胺为交联剂，将丙烯酰胺（单体）聚合而成 ;(2)凝胶过滤的原理;;关系： Vt＝Vo＋Vi＋Vg 由于Vg相对很小，可以忽略不计，则有：Vt＝Vo＋Vi ; 物质在凝胶层析柱被排阻的范围均在均在0～100％之间，被排阻的程度由可用分配系数Kav表示 Kav:分离化合物在内水和外水体积中的比例关系 Kav＝Ve－V0／Vt－V0 分离物分子质量大，Kav值小，反之，则增大 ;Ve一般是介于Vo 和Vt之间的。 对于完全排阻的大分子，洗脱体积Ve＝Vo，Kav=0； 对于完全渗透的小分子，洗脱体积Ve＝Vt，Kav=1； 分子量介于二者之间的分子，它们的洗脱体积也介于二者之间，0Kav1。 ;应用;（二）根据溶解度差别纯化的方法;1. 等电点沉淀和pH控制 ;2. 盐溶和盐析 ;盐溶原理示意图;盐溶主要由于蛋白质分子吸附某种盐类离子后，带电表层使蛋白质彼此排斥，而蛋白质分子与水分子之间的相互作用却加强。 盐析原因：在蛋白质溶液中大量加入中性盐使水的活度降低，原来溶液中大部分自由水转变为盐离子的水化水，从而降低蛋白质极性基团与水分子之间的相互作用，破坏蛋白质分子表面的水化层;盐析原理示意图;应用;;3. 有机溶剂分级法 ;有机溶剂分级分离原理示意图;4 温度对溶解度的影响 ;（三）根据电荷不同的分离方法 1 . 电泳 电泳：带电颗粒在电场中移动的现象。分子大小不同的蛋白质所带净电荷密度不同，迁移率不同，在电泳时可以分开。 ;电泳的发展;;圆盘电泳：玻璃管中进行的凝胶电泳。 平板电泳：铺有凝胶的平板上进行的电泳。 ;; （1） PAGE： PAGE电泳：以聚丙烯酰胺凝胶为支持介质的电泳 凝胶板分为两部分：;高效的分辨率;;;;（2）等电点聚焦;以PAG为电泳支持物，并在其中加入两性电解质载体，在电场作用下，两性电解质载体在凝胶中移动，形成pH梯度，蛋白质在凝胶中迁移至其pI的pH处，即不再泳动而聚焦成带，这种方法称聚丙烯酰胺等电聚焦电泳(isoelectric focusing，IEF);;（3）双向凝胶电